KCTD10作为同向转录-复制冲突传感器通过CUL3介导的TCEA2泛素化重塑RNA聚合酶复合体

本研究揭示KCTD10通过其PIP box同时结合复制体（PCNA）和转录机器（RNAPII），特异性感知同向转录-复制冲突（co-directional TRCs）。研究人员发现KCTD10招募CUL3形成E3泛素连接酶复合体，介导转录延伸因子TCEA2的泛素化降解，从而促进RNA聚合酶II复合体重塑，允许复制体绕过转录障碍。该机制为理解真核生物如何协调转录与复制以维持基因组稳定性提供了新框架。

　　

在真核细胞中，DNA复制和转录过程共享相同的DNA模板，不可避免地会产生转录-复制冲突（Transcription-Replication Conflicts, TRCs）。这种冲突已成为哺乳动物基因组不稳定的重要来源，尤其当复制体与转录机器发生碰撞时。尽管头向冲突（head-on TRCs）被认为更容易引起DNA损伤，但同向冲突（co-directional TRCs）在特定背景下同样具有危害性。一个核心科学问题悬而未决：细胞如何促进复制体在TRCs位点的绕过？

近期发表在《Nature》的研究揭开了这一谜题的关键机制。美国梅奥诊所的研究团队发现，CUL3-KCTD10 E3连接酶系统能够感知TRCs并促进RNA聚合酶复合体的重塑，从而允许复制体绕过。这项研究不仅揭示了KCTD10作为分子桥梁的双重功能，还发现了TCEA2作为泛素化新靶点的重要性。

研究人员综合运用免疫沉淀、蛋白质组学分析、体外结合实验、免疫荧光成像、DNA纤维 assay、邻近连接 assay（PLA）、iPOND技术、CUT&RUN基因组定位以及基于CRISPR的功能筛选等技术方法，建立了从分子机制到功能验证的完整证据链。研究使用的细胞系包括U2OS、HEK293T和HeLa等常见人源细胞系。

KCTD10调控复制与转录

研究发现KCTD10缺失会导致间期细胞γH2AX foci增加，细胞对催化型TOP2抑制剂ICRF193和ICRF187的细胞毒性作用显著敏感化。值得注意的是，KCTD10缺失并不使癌细胞对经典TOP2毒物（如依托泊苷）或电离辐射敏感，提示其作用机制的特异性。

DNA纤维实验显示KCTD10缺陷细胞具有较慢的复制叉推进速度，表明KCTD10可能促进适当的复制叉进展。有趣的是，尽管KCTD10对DNA复制有明确影响，但基因本体分析显示与KCTD10表型聚集的基因强烈富集于转录相关通路和泛素通路，提示KCTD10在转录调控中可能发挥作用。

KCTD10响应同向TRCs

研究人员利用附加体质粒系统研究头向和同向TRCs，发现KCTD10缺失导致由同向TRCs引起的POLR2A-PCNA邻近配对显著增加，而对头向TRCs没有影响。这表明CUL3-KCTD10可能特异性解决同向TRCs。

CUT&RUN测序发现，在ICRF193处理后，KCTD10结合峰显著增加，这些峰主要与启动子1kb内区域相关。通过整合复制叉方向（RFD）和转录方向分析，研究人员发现77%的KCTD10相关峰表现出同向TRCs特征。

催化型TOP2抑制剂引起TRCs

研究表明，短期ICRF193处理诱导γH2AX和53BP1 foci形成，这种损伤在KCTD10缺失的S期细胞中加剧。与依托泊苷相比，ICRF193诱导的DNA损伤积累更缓慢。TOP2B缺失减少了ICRF193处理后的DNA损伤 foci数量，表明这种损伤依赖于TOP2B的存在。

KCTD10对TRCs的双价识别

iPOND实验显示KCTD10定位于新生DNA。PLA实验证实KCTD10与PCNA的邻近关系，且这种关系在ICRF193处理后增强。免疫共沉淀实验显示Flag标记的KCTD10强烈共富集PCNA和RNAPII大亚基POLR2A。

结构预测和生化实验表明，KCTD10通过其PIP box与PCNA和POLR2A相互作用。KCTD10的二聚化或寡聚化对于解决TRCs至关重要，R167A突变体无法恢复CUL3向RNAP复合体的招募。

KCTD10招募CUL3至同向TRCs

尺寸排阻色谱显示，ICRF193处理后，KCTD10、PCNA和POLR2A倾向于共同洗脱。在这些共同洗脱的组分中，KCTD10免疫共沉淀PCNA和POLR2A，表明KCTD10可能在TRCs处与这两种蛋白形成复合物。

CUL3-POLR2A邻近配对在ICRF193处理后富集，且在KCTD10缺失时显著减少。类似表型也见于泛素-POLR2A邻近配对实验。在表达ECFP报告基因的细胞中创建同向TRCs也能诱导CUL3-POLR2A配对。

KCTD10与POLR2C和TCEA2相互作用

AlphaFold多聚体预测显示，KCTD10与RNAPII亚基POLR2C(iPTM=0.62)和TFIIS同工型TCEA2、TCEA3具有高亲和力。结构预测表明，KCTD10的C末端尾部靠近PIP box的区域插入到POLR2C形成的沟槽中，而KCTD10中一个未表征的混合二级结构域与TCEA2的domain II相互作用。

KCTD10介导TCEA2泛素化

研究发现TCEA2在ICRF193处理后发生强烈泛素化，且这种泛素化在KCTD10缺失时显著减少。定位修饰位点发现K184是ICRF193处理后TCEA2的主要泛素化位点。

长时间ICRF193处理（6小时）导致染色质结合的RNAPII和TCEA2减少，这种减少依赖于KCTD10。KCTD10缺陷细胞显示染色质结合的TCEA2和RNAPII显著增加，且POLR2A与TCEA2的相互作用增强。

研究结论与意义

这项研究揭示了KCTD10作为哺乳动物复制体的关键组分，通过促进复制体在TRCs位点的绕过来维持基因组稳定性。研究发现KCTD10能够同时结合复制机器（通过PCNA）和转录机器（通过POLR2C和TCEA2），这种双价识别能力使其能够特异性感知同向TRCs。

机制上，KCTD10招募CUL3形成E3泛素连接酶复合体，介导TCEA2在K184位点的泛素化，促进其从染色质上移除，从而使RNAPII复合体从延伸 competent状态转变为低能量状态，允许复制体绕过转录障碍。在缺乏KCTD10的情况下，RNA聚合酶保留TCEA2并保持在活跃的延伸 competent复合体中，这种状态变得永久停滞，不利于复制体绕过，最终可能导致DNA双链断裂并激活ATM-CHK2介导的DNA损伤应答。

该研究不仅揭示了协调转录与复制的新机制，还为理解某些癌症治疗药物的作用机制提供了新视角。KCTD10缺陷细胞对TOP2催化抑制剂、ATM或CHK2抑制剂的敏感性增加，提示CUL3-KCTD10通路可能成为癌症治疗的潜在靶点。