HIV衣壳穿越核孔复合体的分子机制：表面氨基酸组成的非典型特征驱动FG相分配

本研究针对HIV-1衣壳如何穿越核孔复合体（NPC）这一关键科学问题，揭示了其表面氨基酸组成的独特特征：衣壳表面高度缺乏FG排斥性残基（如K、D、E），而富含FG吸引性残基，使其能够像核转运受体（NTR）一样溶解于NPC的FG相中。研究人员通过衣壳组装实验、FG相分配测定、NPC靶向实验及冷冻电镜技术，发现不仅六聚体衣壳蛋白的N57口袋介导FG结合，五聚体同样贡献显著；引入FG排斥性氨基酸会严重损害衣壳的FG相分配和NPC穿越能力。该研究阐明了HIV衣壳自主穿越NPC的分子基础，为抗病毒策略提供了新靶点，并提出了宿主因子CPSF6通过屏蔽衣壳表面FG吸引性促进其核质释放的新模型。

　　

在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染非分裂细胞的过程中，其基因组需要穿越完整的核膜进入细胞核，这一过程对病毒的成功整合和复制至关重要。长期以来，科学界认为HIV的衣壳（capsid）在细胞质中解离，仅由病毒基因组组成的预整合复合体（pre-integration complex）被导入细胞核。然而，近年来的研究发现，完整的HIV衣壳能够进入细胞核，甚至被直接观察到在核孔复合体（nuclear pore complexes, NPCs）处滞留。这一发现颠覆了传统认知，但也引出了新的谜题：HIV衣壳是一个直径约60纳米、长度约120纳米的巨大结构，如何能像蛋白质一样穿越NPC？

NPC是嵌入核膜的巨大蛋白复合物，负责核质之间的物质运输。其通透性屏障可理解为一个由FG重复序列结构域缩合形成的FG相（FG phase）。这个相排斥惰性大分子，但允许核转运受体（nuclear transport receptors, NTRs）及其结合的货物通过。NTRs，如入核素（importins），通过其表面的FG结合口袋与FG重复序列相互作用，从而“熔化”进入FG相，实现穿越。2024年的两项开创性研究发现，成熟的HIV-1衣壳在体外能像NTR一样高效地分配进入FG相，并在半通透细胞中靶向NPC，但其分子决定因素尚不完全清楚。

为了揭开HIV衣壳扮演NTR角色的分子奥秘，由Liran Fu、Shiya Cheng、Dietmar Riedel、Leonie Kopecny、Melina Schuh和Dirk G?rlich组成的研究团队开展了系统研究，其成果发表在《Nature Structural & Molecular Biology》上。研究人员发现，驱动衣壳穿越NPC的关键并非仅依赖于先前认识的FG结合口袋，其整个外表面的异常氨基酸组成起到了决定性作用。

研究人员首先确认了衣壳穿越NPC的能力不仅依赖于六聚体衣壳蛋白（CA hexamers）上已知的N57 FG结合口袋，五聚体衣壳蛋白（CA pentamers）同样贡献显著。他们利用CA-G60A+G61P双突变体组装了仅由12个五聚体构成的20纳米T1球形衣壳，并发现其与六聚体主导的锥形衣壳样颗粒（capsid-like particles, CLPs）和40纳米球形衣壳一样，能高效地分配进入由Nup98型GLFG重复序列形成的FG相，分配系数高达~1000，远高于未组装的CA单体。在蛙源XTC-2细胞（其Nup358缺乏CypH结构域）中，五聚体衣壳同样能高效靶向NPC，证明其FG相互作用是保守且不依赖于物种特异性FG结构域或CypH域的。

然而，仅凭N57口袋并不足以解释所有现象。N57A突变虽然严重损害了所有类型衣壳的FG相分配，但并未完全消除其与FG相的表面结合，暗示还有其他表面特征在起作用。灵感来源于此前将绿色荧光蛋白（GFP）工程化成NTR的研究，该研究团队曾总结出一个氨基酸表面尺度：天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）和赖氨酸（K）是强FG排斥性残基，而疏水残基、半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸和精氨酸则是FG吸引性残基。他们注意到，与mCherry或GAPDH等典型可溶性球蛋白相比，HIV-1衣壳的外表面（特别是暴露的环区：环1（β-发夹）、环2（CypA结合环）和环3）惊人地缺乏FG排斥性残基（D、E、K），而是由FG吸引性或中性残基主导。

为了验证这一观察的功能意义，研究人员设计了一系列衣壳表面突变体。他们将暴露环上的特定残基突变为FG排斥性的谷氨酸（E）或赖氨酸（K）。实验发现，将环1顶端的Q9、环2上的V86、A88、I91、A92、M96或环3上的P123突变为E，或者将R97（精氨酸，FG吸引性）突变为K（赖氨酸，FG排斥性），会严重损害锥形CLPs的FG相分配，使其滞留于FG相表面，无法完全浸入。这些效应是加成的：Q9E+A92E双突变或V86E+A88E+I91E+A92E四重突变几乎完全消除了衣壳的FG相分配能力。更重要的是，这些FG排斥性突变同样严重损害了衣壳在数字化处理的HeLa细胞中对NPC的靶向。在鼠卵母细胞中，细胞质注射的野生型衣壳在过表达宿主因子CPSF6时能有效穿越NPC并聚集于核斑（nuclear speckles），而N57A突变体则被阻滞在核膜上，V86E+A88E+I91E+A92E四重表面突变体甚至无法有效靶向核膜。

研究表明，宿主因子CPSF6在调控衣壳NPC穿越的终止中扮演关键角色。CPSF5-CPSF6复合物能有效拮抗衣壳分配进入FG相，而CPSF6的单一FG基序突变（F284G）则使其丧失此能力。有趣的是，五聚体衣壳对CPSF6的抑制作用不敏感，这与之前报道的五聚体无法结合CPSF6 FG肽的结果一致，提示CPSF6的FG肽在空间上更适于结合六聚体的N57口袋。研究人员提出模型：CPSF6通过其FG肽竞争结合N57口袋，同时其富含脯氨酸的低复杂度区域（PR-LCR）通过模糊的疏水相互作用“屏蔽”衣壳的FG吸引性表面，并将其外层切换为FG排斥性（由其带负电的N端介导），从而将衣壳从FG相中“提取”出来，释放入核质。这一过程是方向性的，因为CPSF6本身是核定位的。

本研究综合运用了多种关键技术方法。衣壳蛋白（CA）在大肠杆菌中重组表达，并通过Ni²⁺螯合层析和蛋白酶切去除标签进行纯化。锥形衣壳样颗粒（CLPs）、40纳米球形衣壳和20纳米五聚体球形衣壳在肌醇六磷酸（IP6）存在下进行体外组装，并通过尺寸排阻色谱和负染电子显微镜（negative-stain EM）验证组装正确性。FG相分配实验使用由完美重复的12聚体GLFG、SLFG或FSFG重复序列结构域形成的相进行，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定量荧光标记探针的分配系数。NPC靶向实验使用数字化处理（permeabilized）的HeLa细胞和蛙源XTC-2细胞，与荧光标记的抗Nup133纳米抗体共孵育后通过CLSM成像。功能研究通过鼠卵母细胞胞质注射荧光标记衣壳并进行活细胞CLSM成像，并辅以mRNA注射过表达宿主因子CPSF6。分子相互作用模型通过AlphaFold3进行预测。

Hexameric and pentameric capsomers confer an efficient FG barrier entry

研究人员发现，不仅六聚体衣壳蛋白，五聚体衣壳蛋白同样能介导高效的FG相分配和NPC靶向。通过组装仅由五聚体构成的20纳米T1球形衣壳，他们证明其分配进入GLFG、SLFG和FSFG相的能力与六聚体主导的衣壳相当，且不依赖于Nup358的CypH结构域。N57A突变同样损害五聚体衣壳的FG相分配，表明其N57口袋也参与形成 energetically relevant 的氢键。

The highly exposed capsid surface has a very unusual amino acid composition

通过比对分析，研究揭示HIV-1衣壳的外表面（特别是暴露环区）极度缺乏FG排斥性残基（D、E、K），而这些残基在大多数可溶性球蛋白表面非常丰富。这种独特的组成 bias 暗示其与衣壳的NTR样行为相关。

The lack of FG-repulsive residues on the capsid surface is key to FG phase entry

通过系统性的点突变实验，研究人员证实将暴露表面的特定残基（如Q9, V86, A88, I91, A92, M96, P123）突变为FG排斥性的谷氨酸（E），或将R97突变为赖氨酸（K），会严重损害衣壳的FG相分配，导致其滞留于FG相表面。这些效应的严重程度与残基的暴露程度相关，并且突变效应是可加成的。

Additive effects of capsid-partitioning mutations

组合突变（如Q9E+A92E双突变或V86E+A88E+I91E+A92E四重突变）能进一步降低甚至完全消除衣壳的FG相分配和表面结合能力，证明这些表面特征的重要性独立于且叠加于N57口袋的功能。

Capsid mutations that impede FG phase partitioning also interfere with NPC targeting

在功能上，上述FG相分配缺陷突变体同样严重损害了衣壳在 semipermeabilized HeLa 细胞中对NPC的靶向，证明FG相分配是NPC靶向的物理基础。

Large CLPs completely pass mouse oocyte NPCs when CPSF6 is overexpressed

在鼠卵母细胞模型中，细胞质注射的大型锥形CLPs在 endogenous CPSF6 水平下主要滞留于核膜（NPCs），但当核内CPSF6水平通过mRNA过表达升高时，CLPs能有效完成NPC穿越，积累于核内的 speckles。这表明CPSF6是促进衣壳从NPC释放的关键因子。

FG-repelling surface mutations block the NPC passage of capsids

细胞质注射的N57A突变体CLPs被阻滞在核膜上，而V86E+A88E+I91E+A92E四重表面突变体则完全无法靶向核膜，证明了表面氨基酸组成对完整NPC穿越过程的必要性。

CPSF6 potently antagonizes capsid partitioning into an FG phase

生化实验表明，CPSF5-CPSF6复合物能有效拮抗衣壳分配进入FG相，而CPSF6的FG基序突变（F284G）则使其丧失此能力。五聚体衣壳对CPSF6的抑制不敏感，这与它们无法结合CPSF6 FG肽的特性一致。

该研究得出结论，HIV-1衣壳通过其独特的表面氨基酸组成（富含FG吸引性残基，缺乏FG排斥性残基）以及高 multiplicity 的N57 FG结合口袋，进化成了一种高效的NTR类似物，能够自主溶解于NPC的FG相中，从而实现巨大结构的核输入。这种表面特性使其能够通过大量瞬时的、单个表面侧链与FG相发生的吸引性相互作用而实现“溶解”。宿主因子CPSF6则通过竞争结合N57口袋并屏蔽衣壳的FG吸引性表面，将其转变为FG排斥性物种，从而促进衣壳从NPC屏障中释放进入核质，完成感染的最后一步。

该研究的意义深远。首先，它揭示了蛋白质表面氨基酸组成本身可以编码 topogenic 信息，决定其与生物分子凝聚相（如FG相）的相互作用命运。其次，它阐明了HIV及其他慢病毒有效感染非分裂细胞的分子机制，为针对衣壳-NPC相互作用的新型抗病毒策略提供了精确的靶点（例如，设计小分子干扰衣壳表面的FG吸引性）。再者，研究提出的“表面屏蔽”释放机制（由CPSF6执行）为理解核转运的方向性调控提供了新的范式，类似于RanGTP调控货物从入核素上释放。最后，该工作展示了生命体在进化过程中如何通过精细的序列优化（避免聚集的同时获得特定相互作用能力）来解决复杂的生物学问题，是蛋白质功能演化的一个杰出范例。