CD8+坏死区肿瘤浸润淋巴细胞（nTILs）密度预测非小细胞肺癌新辅助免疫化疗预后：优于病理与影像学评估的新标志物

本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）新辅助免疫化疗后病理反应评估（MPR）预测效力不足的问题，通过多中心回顾性分析200例患者样本，首次发现坏死区域内CD8+ TILs（nTILs）密度与患者无事件生存期（EFS）显著相关（HR=0.08）。该指标独立于PD-L1状态、淋巴结转移及MPR分层，且优于传统病理和影像学评估，为个体化治疗决策提供了新依据。

　　

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管手术是早期疾病的标准治疗方式，但许多患者术后仍会复发。新辅助系统免疫治疗通过利用肿瘤抗原的大量释放，有效激活免疫系统，促进对微转移灶的免疫监视和清除。临床上，新辅助免疫化疗已显示出有希望的结果，并被广泛用于NSCLC的治疗。然而，当前评估治疗获益的金标准——总生存期改善——需要长达5-10年的数据收集时间。为了克服这一挑战，替代终点的开发允许更有效地评估治疗疗效，可大大缩短临床试验和药物开发的时间和成本。

在此背景下，新辅助治疗的另一个优势在于，对手术标本的检查能够在几周内对治疗疗效进行病理评估。因此，评估残余存活肿瘤（RVT）已成为新辅助治疗方案中的替代终点。根据RVT的百分比，患者结果可分类为达到完全病理反应（pCR，0% RVT）、主要病理反应（MPR，≤10% RVT）或非主要病理反应（non-MPR，>10% RVT）。然而，RVT百分比未能充分区分同一病理反应组内的结果。重要的是，约20%达到MPR甚至pCR的患者在3年内仍会经历复发，凸显了当前指标的不充分性。这迫切需要在可靠评估治疗疗效、准确预测患者结果和指导治疗策略决策方面，寻找新的替代终点。

地理性肿瘤坏死是一种独特的组织病理学现象，其特征是融合的死亡组织区域。肿瘤坏死的标志是完全缺乏存活肿瘤细胞、正常组织结构和细胞结构细节的丧失，以及无定形嗜酸性细胞碎片的积累。历史上，肿瘤necrosis的存在被认为是侵袭性肿瘤生物学的标志。它通常与快速增殖的恶性肿瘤相关，这些肿瘤的生长超过了其血液供应，导致缺血性细胞死亡、肿瘤微环境内的免疫抑制以及不利的临床结果。有趣的是，新辅助免疫治疗引发免疫介导的肿瘤细胞死亡，这也可能导致坏死。尽管将免疫治疗与地理性坏死直接联系起来的证据有限，但一些临床观察支持这种关联。例如，在黑色素瘤和肝细胞癌患者中的研究报告称，在新辅助免疫检查点阻断后，坏死肿瘤区域显著增加；这可能反映了成功的免疫细胞介导的肿瘤杀伤，为治疗疗效和肿瘤-免疫相互作用提供了宝贵的见解。

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是抗肿瘤免疫的 integral mediators，并已被确立为 across multiple cancer types 对免疫治疗反应的关键决定因素。研究表明，治疗前活检中TILs的密度和空间分布可用于预测免疫治疗的疗效。然而，在新辅助治疗后，肿瘤微环境通常被淋巴细胞广泛浸润，从而损害了TIL密度作为预后生物标志物的区分能力。在根除肿瘤细胞后，T淋巴细胞经历caspase依赖性或caspase非依赖性细胞死亡。有趣的是，新兴证据表明，尽管肿瘤坏死区域内的淋巴样细胞失去了它们的结构完整性，并且通过常规苏木精和伊红（H&E）染色无法检测到，但某些T细胞特异性抗原可能仍然持续存在。这种抗原标志物的保存使得能够通过免疫组织化学（IHC）识别坏死区域内的TILs（nTILs），为研究坏死肿瘤内发生的免疫活动提供了一个潜在的窗口。这些nTILs，在介导肿瘤细胞杀伤后，代表了宿主对免疫治疗反应的最直接指标之一。在黑色素瘤中的研究表明，CD3+和CD8+ nTILs的存在与新辅助抗PD-1治疗后的病理反应相关。然而，由于样本量有限，以前的研究无法全面评估nTILs与肿瘤中其他已建立的预后标志物之间的相关性。nTILs在NSCLC中的临床相关性和预测价值仍未探索。

在此，我们对200名NSCLC患者治疗后样本的CD3和CD8 IHC染色分析揭示了残留肿瘤床中TILs的高度异质性空间分布，并首次全面评估了肿瘤、消退和坏死区域中的TILs。我们的研究结果表明，虽然肿瘤和消退区域内的CD3+和CD8+ TIL密度与无事件生存期（EFS）相关性很小，但坏死区域内的CD8+ TIL密度与患者预后有很强的关联。此外，CD8+ nTIL密度是一个强大的预测患者结果的标志物，无论基线肿瘤PD-L1表达状态、手术前淋巴结转移的存在或是否达到MPR。我们的研究结果表明，CD8+ nTIL密度在预测EFS方面比当前指标（如病理和影像学反应）更精确。CD8+ nTIL有潜力作为独立预测因子或与病理反应结合使用以指导治疗决策。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：研究基于来自三个医疗中心的229例NSCLC患者的临床数据和样本进行回顾性分析，最终纳入200例符合标准的患者。通过免疫组织化学（IHC）对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行CD3和CD8染色，以定量检测坏死区域内的TILs（nTILs）。病理反应由两名病理学家根据免疫相关病理反应标准（irPRC）独立评估，包括残余存活肿瘤（RVT）百分比、肿瘤消退和坏死。影像学反应根据RECIST 1.1标准通过CT或MRI进行评估。无事件生存期（EFS）由盲法独立中心审查评估。统计分析采用Kaplan-Meier法、log-rank检验、Cox比例风险模型和受试者工作特征（ROC）曲线分析。

Patient population

总共229名在三个医疗中心接受新辅助PD-1阻断加化疗后手术的NSCLC患者符合纳入条件；其中29名患者因远处转移、诊断时年龄或治疗周期过多而被排除在分析之外。在200名可获得临床病理数据的患者中，99名有坏死区域的患者符合nTIL评估条件，186名有影像学反应数据的患者符合比较分析条件。所有合格患者均被纳入相关分析，无任何其他选择标准。数据库于2024年12月12日锁定；最短随访时间为12个月，中位随访时间（存活者）为26个月。该队列由160名（80%）被诊断为肺鳞癌（LUSC）的患者和40名（20%）肺腺癌（LUAD）患者组成。病理评估患者群体的基线特征总结于表1。

Pathological response and TILs

根据泛肿瘤免疫相关病理反应标准（irPRC）进行病理评估。具体而言，在肿瘤床（即肿瘤先前所在的区域）评估了包括%RVT、肿瘤消退和坏死在内的特征。病理学显示，59%的患者达到pCR或MPR，而41%的患者为non-MPR。

为了确定TILs与病理反应之间的关系，我们对NSCLC队列的肿瘤样本进行了CD3和CD8 IHC染色。与先前的研究一致，在MPR患者中，肿瘤和消退区域的TIL数量相对较高。然而，相关性并不具有统计学意义。有趣的是，尽管坏死区域内的T淋巴细胞残余不再保留其细胞结构，但常见T细胞特异性抗原的痕迹仍然存在，从而可以检测到nTILs。nTILs的密度在不同的NSCLC患者中存在差异。为了确定患者结果与不同nTILs亚群之间的相关性，我们计算了单位坏死面积中CD3+ nTILs和CD8+ nTILs的数量。具有较高%RVT的患者其nTIL密度显著较低，并且具有不利临床结果（复发或死亡）的患者其CD8+ nTIL密度显著较低。此外，我们发现具有 elevated levels of CD8+ nTILs and CD3+ nTILs 的患者在MPR组中比在non-MPR组中更普遍。此外，CD8+ nTIL密度与PD-L1状态或淋巴结（LN）转移之间观察到 little correlation。

LUSC是我们队列中最常见的癌症亚型（n=160）。在剩余的40个LUAD样本中，22个包含坏死区域，其中平均CD8+ nTIL密度为...

Pathologic response and EFS

先前的研究表明，在接受新辅助免疫治疗的NSCLC患者中，升高的%RVT与不良预后相关。与non-MPR患者相比，MPR患者的EFS显著改善（EFS率：MPR为85.9%，non-MPR为61.7%；HR=0.46, 95% CI: [0.22-0.92], p=0.025）。其他病理参数与EFS的关联见补充表3。然而，%RVT的预测价值有限，因为它未能在MPR和non-MPR组内进一步分层复发风险。与先前研究观察到的不同，%消退与EFS没有显著相关性。新辅助治疗后坏死>30%的患者预后有所改善，尽管差异无统计学意义。值得注意的是，坏死>30%患者的4年EFS率为96.8%，而坏死<30%的患者为64%。为了进一步描绘这种相关性，比较了MPR和non-MPR患者的%坏死。MPR患者的中位%坏死为30%，显著高于non-MPR患者，表明在NSCLC中，新辅助免疫化疗可能导致治疗性肿瘤坏死。

CD8+ and CD3+ nTILs and EFS

在评估TILs与EFS之间的关系时，我们最初报告称，在肿瘤和间质区域具有中度或活跃CD3+/CD8+ TILs的患者与那些缺乏/极少TILs的患者相比，复发风险较低。然而，差异并不显著，并且基于TILs准确预测复发风险的能力仍然有限。

重要的是，坏死区域内的TIL密度与患者预后密切相关。CD8+ nTIL密度高（ cutoff 为CD8+ nTILs的中位密度，中位数=0.41 nTIL/mm²）的患者EFS显著更长（HR=0.08, p=0.0019）。虽然CD3+ nTIL密度较高的患者EFS也更长，但相关性不显著。使用一个将CD8+ nTILs和病理反应作为因素的单变量Cox比例风险模型，我们发现高CD8+ nTIL密度在MPR（HR=1.12e-09, 95% CI: [0-Inf], p=0.017）和non-MPR（HR=0.185, 95% CI: [0.02-1.49], p=0.076）组中均与更好的结果相关。这些发现表明，CD8+ nTILs是EFS的一个强大指标，补充了病理反应在预测新辅助治疗结果方面的作用。

LN involvement

为了确定淋巴结（LN）中残留肿瘤的存在与否是否影响新辅助治疗后CD8+ nTIL密度对结果的预测，我们首先比较了按LN转移状态分组的患者之间的EFS，并观察到在无LN残留肿瘤的患者组中EFS有适度改善。当我们关注具有坏死的患者亚群，并评估不同LN转移状态组之间CD8+ nTILs与EFS的相关性时，我们发现高CD8+ nTILs与更长EFS之间的关联在无论LN是否受累的两个组中都是一致的。值得注意的是，在数据库锁定时，没有高CD8+ nTILs且无LN残留肿瘤的患者经历肿瘤复发。

CD8+ nTILs versus pathological and radiological responses

病理和影像学反应通常用作评估新辅助治疗疗效的替代指标。在我们的NSCLC队列中，对新辅助治疗后残留疾病的影像学和病理学评估的比较揭示了显著差异，因为影像学成像通常无法预测治疗结果。例如，在一个代表性病例中，影像学评估显示肿瘤大小仅略有减少，而切除的肿瘤在病理上被分类为pCR，并伴有高密度的CD8+ nTILs。尽管具有较好影像学反应的患者通常表现出较低的%RVT，但病理和影像学反应之间的相关性极小（R=-0.029; p=0.78）。总共118名达到MPR或pCR的患者中有45名根据RECIST 1.1未表现出影像学反应。类似地，CD8+ nTIL密度与影像学反应之间观察到弱相关性（R=-0.18, p=0.079）。此外，影像学反应与EFS不相关，响应者和非响应者之间的EFS无显著差异。

通过单变量模型评估CD8+ nTILs、CD3+ nTILs、病理反应和影像学反应对生存的影响，我们发现CD8+ nTIL密度是坏死患者中唯一与结果显著相关的因素。CD8+ nTILs表现出卓越的预测能力，这在受试者工作特征曲线（ROC）分析中的高AUC值得到证实。这些发现突显了CD8+ nTIL密度作为一个强大而可靠的患者结果预测指标，优于传统的影像学和病理学指标。

讨论（DISCUSSION）

本研究发现在接受新辅助免疫化疗的NSCLC患者中，高水平的CD8+ nTILs与改善的EFS密切相关。CD8+ nTILs的预测价值独立于PD-L1状态、淋巴结转移和肿瘤分级等临床指标，并且无论是否达到MPR，升高的CD8+ nTIL水平都预示着改善的EFS。此外，CD8+ nTIL密度在预测治疗结果方面优于影像学和病理学反应。这些发现强调了CD8+ nTILs在免疫化疗反应中的关键作用，并强调了它们作为新辅助免疫化疗可靠预测指标的潜力。

目前，治疗疗效和患者预后的预测可以在接受新辅助治疗后几周内使用基准进行，这大大加速了药物开发并促进了监管批准。病理反应通常作为多种癌症类型患者结果的替代终点。该终点已成功用于获得FDA的监管批准，并且是目前预测新辅助治疗后患者预后最具成本效益的方法之一。然而，虽然病理反应与EFS相关，但预测并非完全可靠。例如，14.1%的达到pCR或MPR的NSCLC患者在4年内经历复发，而61.7%的non-MPR患者在相同时间范围内无复发。此外，%RVT难以在同一病理亚组内对患者结果进行分层。治疗前样本中的TILs已被认为可以预测对新辅助免疫化疗的反应。然而，治疗后手术标本中TILs的密度和空间分布是否能预测肿瘤复发风险仍不清楚。TIL群体是高度异质性的，肿瘤微环境内不同的淋巴细胞亚群通常在肿瘤免疫中扮演相反的角色。由于传统的H&E染色无法区分这些功能不同的TIL亚群，我们使用CD3和CD8 IHC染色来量化和空间解析细胞毒性T细胞。我们的分析揭示了CD3+和CD8+ TIL分布的巨大空间异质性，消退区域的密度通常高于肿瘤区域。在肿瘤或消退区域具有中度或活跃CD3+/CD8+ TILs的患者与那些缺乏/极少TILs的患者相比，呈现较低的复发风险。然而，这些相关性并不显著，这可能是因为大多数接受新辅助免疫化疗的患者残留病变中TIL密度相对较高。我们的分析表明，新辅助免疫治疗后CD8+ nTIL密度可以改善那些仅凭病理反应不足的患者的预后预测。在达到MPR的患者中，那些CD8+ nTIL密度低的患者仍然面临相当大的复发风险。相反，在未达到MPR的患者中，高CD8+ nTIL密度仍然预示着良好的预后。

使用肿瘤坏死作为新辅助治疗疗效的预测指标仍然存在争议。在我们的分析中，尽管观察到%坏死与某些预后终点之间存在 tentative association，但相关性未达到统计学显著性。这些结果表明，仅凭坏死是不充分且不可靠的治疗结果预测指标。一个主要的复杂因素是未经治疗的NSCLC中固有的自发性坏死的存在，这在晚期疾病中更为普遍。通过病理测试区分功能不同的坏死形式至关重要且具有挑战性。自发性坏死有助于肿瘤进展，但治疗诱导的坏死反映了治疗疗效。免疫治疗依赖TILs实现有效的肿瘤细胞根除；因此，我们假设免疫治疗诱导的坏死在免疫学上是活跃的，并以nTILs的显著富集为特征。这一特征可能用于将其与通常由缺血性应激引起且没有大量CD8+ T细胞浸润的自发性坏死区分开来。这一假设得到了我们的发现的支持，即CD8+ nTILs密度与病理反应程度之间存在强正相关。

我们观察到影像学反应与既定临床终点（包括病理反应和EFS）之间的相关性有限。这一发现强调了仅依赖传统基于成像的评估作为治疗疗效替代指标的潜在不足，这可能导致对患者结果的 skewed or incomplete evaluation。这种差异可能源于免疫治疗的作用机制，它引发了由肿瘤微环境内T细胞介导的独特反应模式。这些现象常常使治疗后肿瘤大小和密度的影像学解释复杂化，限制了基于图像的指标捕捉真实生物学和临床益处的准确性。

我们承认研究存在几个局限性。首先，来自不同医疗中心的nTIL计数差异可能会影响患者的相关性评估。为了解决这个问题，我们计划开发基于机器学习的软件用于nTIL密度测量，这将标准化评估过程，并能够整合来自不同研究组的独立研究分析。其次，我们选择中值0.41（CD8+ nTILs per mm²）作为 cutoff，这导致了一个强大的预测模型，而无需进一步尝试其他 cutoff 值。第三，一小部分患者的一些数据缺失，包括41名患者的PD-L1状态和14名患者的影像学反应信息；这可能降低了分析的统计效力。此外，200名患者的队列仍然不足，限制了我们系统整合所有相关病理特征的能力。因此，无法确定每个预后因素对风险预测的精确贡献，也无法开发一个强大且优化的预测模型。未来，更大规模的队列研究将使我们能够确定最佳 cutoff 值，并进一步验证CD8+ nTILs与其他临床标志物之间的关联。

总之，我们的研究建立了首个全球基准，用于表征NSCLC患者对新辅助PD-1阻断联合化疗反应中的nTILs。我们证明，通过标准化IHC染色量化的CD8+ nTIL密度代表了一种临床可行、可重复且易于实施的预测治疗结果的方法。其实用性在于能够提供比现有方法更精确的预后信息，有望指导临床决策和未来临床试验设计。