血浆细胞外囊泡蛋白CELA3A/CELA3B/CTRC：糖尿病视网膜病变进展的新型生物标志物鉴定研究

本刊推荐：为解决糖尿病视网膜病变(DR)缺乏早期诊断标志物的临床难题，研究人员通过蛋白质组学技术开展血浆细胞外囊泡(EVs)蛋白标志物筛选研究。研究发现CELA3A、CELA3B和CTRC蛋白在DR进展中显著上调，其组合面板对区分NPDR/PDR与DM的AUC值>0.7，且与TG、HDL等临床指标显著相关。该研究为DR进展监测提供了新型生物标志物组合，具有重要临床转化价值。

　　

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)作为糖尿病最常见的微血管并发症，已成为工作年龄人群视力损害和致盲的主要原因。全球范围内，2020年约有1.03亿成年人受到DR影响，预计到2045年这一数字将攀升至1.605亿。在中国，DR患病率高达16.3%，约2330万糖尿病患者面临视力威胁。按照疾病进展程度，DR临床分为非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative DR, NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative DR, PDR)，糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema, DME)可在任何阶段发生。传统治疗方法包括激光治疗、玻璃体切除术和抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)药物，主要适用于晚期DR患者。因此，探索用于DR诊断、治疗和预防的新型生物标志物至关重要。

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作为具有脂质双层结构的纳米至微米级颗粒，根据生物发生途径和大小可分为外泌体、微泡等类型。EVs广泛分布于各种生物体液中，富含核酸、蛋白质、脂质和代谢物，是重要的细胞间通讯载体，调节生理和病理过程。越来越多的研究表明EVs在DR中发挥重要作用。然而，基于血浆EVs蛋白质组学分析DR进展的生物标志物研究仍相对缺乏。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，首都医科大学宣武医院眼科团队通过蛋白质组学技术筛选血浆EVs中与DR进展相关的差异表达蛋白，并验证了CELA3A、CELA3B和CTRC蛋白作为DR进展监测标志物的潜在价值。

研究人员采用的主要技术方法包括：1)建立发现队列(6例健康对照、6例2型糖尿病[DM]患者、6例NPDR患者和5例PDR患者)和验证队列(26例健康对照、30例DM患者、26例NPDR患者和25例PDR患者)的临床样本库；2)使用尺寸排阻色谱法结合磁珠富集技术分离血浆EVs，并通过纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)和Western blotting进行表征验证；3)采用4D标记自由定量蛋白质组学技术进行蛋白质鉴定和定量分析；4)通过ELISA技术验证候选蛋白表达水平；5)利用ROC曲线分析和临床指标相关性评估生物标志物的诊断价值。

研究结果

血浆EVs的特征鉴定

研究人员成功从血浆中分离出EVs，其尺寸范围为30-200nm，峰值尺寸为100nm，浓度达到10¹¹颗粒/mL。Western blotting结果显示提取的EVs富含跨膜蛋白CD63和可溶性蛋白HSP70、TSG101(EVs阳性标志物)，而细胞内蛋白Calnexin(EVs阴性标志物)缺失。TEM观察显示杯状圆形颗粒，直径约100nm，符合EVs的形态特征。这些结果表明血浆EVs被成功分离且结构完整，可用于后续分析。

差异表达蛋白(DEPs)的鉴定

4D标记自由技术共鉴定出12,021条肽段和1,830种蛋白质。通过FC>1.2和p值<0.05的标准，筛选出32个DEPs。GO分析显示这些蛋白主要定位于突触和线粒体，参与突触传递功能，如化学突触传递、控制平衡的神经肌肉过程、胰岛素分泌的正向调节、神经递质摄取、神经递质分泌调节和突触小泡胞吐作用。KEGG分析表明DEPs主要与神经退行性疾病、糖尿病心肌病、胰腺分泌和突触小泡循环相关。PPI网络分析显示44个相互作用对涉及25个蛋白质，其中SNAP25具有最高连接度，与11个蛋白质相互作用。

枢纽蛋白的鉴定和临床相关性分析

通过Wilcox检验鉴定出4个枢纽蛋白(CELA3A、CELA3B、CTRC和GLUD1)。研究发现CELA3A和CTRC在HC vs. DM、DM vs. NPDR和NPDR vs. PDR组中的表达水平显著增加。同时，CELA3B和GLUD1在DM vs. NPDR和NPDR vs. PDR组中的表达显著上调。相关性分析显示HbA1c与CELA3A和CTRC呈显著正相关，FPG与CELA3A显著相关。此外，在DME和视网膜出血患者组中，枢纽蛋白的表达水平显著更高。

CELA3A、CELA3B、GLUD1和CTRC表达水平的验证

独立验证队列(n=107)的ELISA结果显示，除GLUD1外，CELA3A、CELA3B和CTRC蛋白的整体表达趋势与蛋白质组学结果一致。有趣的是，CELA3A、CELA3B和CTRC蛋白表达水平在PDR与HC/DM组间存在显著差异，但在NPDR与PDR组间无显著差异。此外，CELA3A和CTRC在NPDR与HC/DM组间也存在显著差异。这表明这三种蛋白可能参与从DM到DR的进展过程。

蛋白质CELA3A、CELA3B、CTRC的ROC分析

为进一步研究三种蛋白的诊断价值，研究人员绘制了ROC曲线。所有三种枢纽蛋白在DM和PDR组间均显示出良好的诊断价值，CELA3A的AUC值为0.908，CELA3B为0.715，CTRC为0.935。值得注意的是，CELA3A和CTRC在DM和NPDR组中也表现出预测潜力，AUC值分别为0.889和0.791。然而，在NPDR和PDR组中诊断准确性较低，AUC<0.6。此外，CELA3A在HC和DM组中的AUC值为0.724。CELA3B的诊断准确性相对较低，DM与NPDR组间AUC=0.608，NPDR与PDR组间AUC=0.635。进一步评估了由3个枢纽蛋白组成的面板在DR分期中的诊断效能，ROC曲线显示在DM vs. NPDR(AUC=0.868)和DM vs. PDR(AUC=0.958)组中具有高诊断效能，而HC vs. DM和NPDR vs. PDR的AUC值均<0.7。上述结果表明CELA3A、CELA3B和CTRC可能作为区分NPDR/PDR与DM的有效生物标志物。

临床指标与蛋白质CELA3A、CELA3B、CTRC的相关性分析

验证队列患者的临床特征显示，在DR病程、FPG、HbA1c、舒张压(DBP)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)方面存在统计学显著差异。进一步分析三种枢纽蛋白与临床指标的相关性，结果显示CELA3A与DR病程、TG和天冬氨酸氨基转移酶(AST)呈显著正相关，与钾(K)呈显著负相关。CELA3B与TG和钙(Ca)呈显著正相关，与HDL呈显著负相关。CTRC与DR病程和TG呈显著正相关，与HDL呈显著负相关。此外，由3个枢纽蛋白组成的面板与发现队列中显著差异的临床特征(DR病程、DME、视网膜出血)呈正相关，其中DR病程和DME具有统计学显著性。

研究结论与讨论

本研究通过蛋白质组学分析发现，血浆EVs中大多数DEPs定位于突触和线粒体，参与神经递质摄取和分泌调节等突触传递功能，这与DR中视网膜神经变性和微血管功能障碍的病理过程密切相关。研究人员成功鉴定出4个枢纽蛋白(CELA3A、CELA3B、GLUD1和CTRC)，其中CELA3A、CELA3B和CTRC的表达验证结果与蛋白质组学一致。

CELA3A和CELA3B是人类胰蛋白酶样弹性蛋白酶家族成员3(chymotrypsin Like elastase family member 3, CELA3)的异构体，由胰腺分泌。研究发现CELA3A原形式和CELA3B活性形式存在于2型糖尿病患者的胰岛微环境中，后者通过调节内分泌细胞功能发挥作用。CTRC被称为糜蛋白酶C，通过降解活化的胰蛋白酶原保护胰腺功能。虽然尚无研究直接报道CELA3A、CELA3B或CTRC与DR的关联，但胰腺功能异常引起的胰岛素分泌不足和血糖控制不佳已被证实是DR发生发展的关键因素。因此，推测这些蛋白可能通过调节胰腺分泌功能影响血糖稳态和视网膜健康，进而参与DR进展。

ROC分析证实了这三种枢纽蛋白及其组合面板在区分NPDR/PDR与DM方面具有良好的诊断价值(AUC>0.7)。临床相关性分析揭示了CELA3A/CTRC与DR病程和TG水平呈正相关，CELA3B/CTRC与HDL呈负相关，CELA3B与Ca水平呈正相关，这些发现与既往关于脂质代谢紊乱与DR进展关联的研究一致。

该研究的重要意义在于首次系统鉴定了血浆EVs来源的CELA3A、CELA3B和CTRC蛋白作为DR进展的新型生物标志物组合，为DR的早期诊断和进展监测提供了新的分子靶点。这些发现不仅深化了对DR病理机制的理解，也为临床开发非侵入性诊断工具提供了重要依据。未来研究需要扩大样本规模验证这些标志物的临床适用性，并进一步探索这些蛋白通过调节胰腺功能影响DR进展的具体分子机制。

总之，本研究通过分析不同阶段DR患者血浆EVs的蛋白质谱，鉴定出32个DEPs，并通过ELISA实验进一步确定了三个枢纽蛋白(CELA3A、CELA3B和CTRC)。ROC分析显示这三种枢纽蛋白及其组合面板在区分NPDR/PDR与DM方面AUC值>0.7(CELA3B在DM-NPDR除外)。这些发现表明CELA3A、CELA3B和CTRC有望作为监测从DM到DR进展的生物标志物，为疾病诊断提供有效指导。