可编程DNA壳支架实现定向膜出芽：仿生囊泡生成与精准药物递送新策略

本研究报道了一种基于DNA折纸技术的仿病毒组装系统，通过胆固醇修饰的三角形结构单元在脂质囊泡表面自组装成多面体壳，实现膜曲率诱导、出芽和自发颈部分裂。研究人员通过调控胆固醇位点实现了芽生长方向的可编程控制，生成具有DNA内骨架或外骨架的子囊泡。该体系具有快速动力学特性且适用于多种脂质组成，为膜力学研究和靶向药物递送提供了新平台。

　　

在细胞生物学中，膜出芽是一种普遍存在的生物现象，母体脂质膜通过形成子囊泡实现物质的跨膜运输。天然系统中，膜曲率变化通常由网格蛋白(clathrin)等弯曲蛋白诱导——其独特的三脚架形状能够与膜结合受体-衔接蛋白复合物结合，自组装成球形笼状结构从而诱导细胞膜变形。尽管近年来研究证实了网格蛋白的膜弯曲特性，但科学家一直在探索能否用其他自组装材料替代蛋白质实现类似功能。DNA折纸技术因其可编程性和精确性成为理想候选：通过将数千碱基长的单链"支架"与短链寡核苷酸混合，经过热退火处理即可折叠成预设的三维结构。

先前研究已成功将跨膜DNA纳米孔与脂质双分子层连接，并证明膜结合DNA折纸结构可保留扩散运动性，实现二维多聚体晶格组装。无论是弯曲还是平面的折纸结构都能诱导巨单层囊泡(GUV)形成管状结构，而膜上聚合的折纸结构同样能引起底层膜变形，类似于细胞出芽过程中的网格蛋白网络。然而，这些系统缺乏自发颈部分裂的能力，且对芽生长方向的控制尚未实现。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Michael T. Pinner和Hendrik Dietz团队开发了一种基于DNA折纸的人工膜出芽系统。该系统核心是三维膜相互作用三角形亚基，通过斜边设计和边缘的形状互补凸起/凹陷结构，引导这些三角形通过碱基堆叠相互作用自组装成二十面体壳。与巨囊泡(GV)脂质膜的相互作用通过折纸结构上的胆固醇(chol)基团促进，膜结合三角形的自组装诱导局部曲率变化，最终导致芽的形成和自发颈部分裂，无需GTP酶（如动力蛋白dynamin）的收缩作用。

研究人员采用先前开发的可编程二十面体壳框架，将二十个等边DNA折纸三角形在氯化镁浓度升高时形成闭合二十面体。为提供与脂质膜结合所需的疏水相互作用，他们在三角形亚基的壳内向面掺入多个胆固醇修饰的寡核苷酸(chol-oligos)。单链连接手柄从三角形底面突出作为chol-oligos的附着位点，采用对称布局保持各边相对位置一致。他们假设三角形在流体膜上的二维扩散可支持二十面体壳的组装，同时拉动膜材料形成逐渐变形的膜芽，最终颈部分裂后产生DNA壳包被囊泡(DCV)释放到溶液中。

通过筛选胆固醇密度和位置以平衡三角形溶解度和膜亲和力，研究人员验证了它们在无膜情况下组装成预期二十面体壳的能力。引入胆固醇导致从相对均匀的二十面体壳转变为包含八面体和二十面体壳的混合物。他们发现连接手柄与外壳边缘的接近程度以及胆固醇配置（近端与远端取向）是影响因素，通过限制每个胆固醇分子的作用范围（如增加壳组装中相邻三角形间胆固醇分离度），可主要恢复为二十面体结构并减少胆固醇介导的聚集。

关键实验技术包括：三维DNA折纸结构的设计与折叠（使用caDNAno软件进行设计编辑）、胆固醇修饰寡核苷酸的杂交连接、巨囊泡的制备与表征（采用聚乙烯醇凝胶溶胀法）、负染透射电镜(ns-TEM)与冷冻电镜(cryoEM)成像分析、琼脂糖凝胶电泳检测组装效率、电子断层扫描三维重构、膜张力调控实验（通过甘氨酸渗透压调节）、生物素-中性亲和素(biotin-NeutrAvidin)替代锚定实验、不同脂质组成囊泡的兼容性测试以及动力学分析研究。

DNA折纸三角形作为分子支架

研究人员调整胆固醇分布后发现，将连接手柄置于中心位置并使用近端胆固醇时胆固醇介导的相互作用最少，因此后续实验均采用此配置。加入脂质膜后系统出现新变量，再次导致八面体结构的产生，这种趋势取决于每个三角形的胆固醇量和脂质囊泡的存在。他们认为这种效应源于力的复杂相互作用，包括膜结合三角形的拥挤、三角形相对排列的改变（可能受局部曲率诱导影响）以及亚基间非理想角度引起的壳内弹性变形。

DCVs的形态特征

通过使用携带3、6或9个胆固醇的三角形进行出芽反应的TEM分析发现，随着胆固醇含量增加，DCV形态发生转变。更多胆固醇基团导致增强的膜结合、更高比例的八面体DCV和总体DCV产量增加。仅携带3个胆固醇的三角形经常形成包裹囊泡过小无法填充壳腔的部分DCV，表明这些条件下膜结合较弱。除二十面体和八面体DCV外，在所有变体中观察到具有五角突起的第三群体，可能代表部分组装的二十面体壳——从五聚体帽到半二十面体中间体。

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影响出芽效率的生物物理参数

作为触发壳组装的浓缩MgCl2溶液添加不可避免地增加样品缓冲液的渗透压，可能通过使囊泡放气改变膜的生物物理特性。高渗应激先前已被用于通过膜结合DNA折纸改变囊泡形状。研究人员通过将三角形覆盖的GVs与增加量的甘氨酸作为渗透剂混合研究膜张力对DCV产量的影响。有趣的是，DCV产量与渗透环境强烈相关。在低渗状态下观察到中等至低产量，而最高渗透压条件下获得最显著产量。这些发现揭示了膜张力与DCV产量之间的直接关系，强化了DCV源于复杂膜重塑过程的观点。

向内出芽

通过将胆固醇位置从三角形底面（壳向内）转移到顶面（壳向外），研究人员假设可以逆转出芽方向性，这一过程类似于胞吐作用。由于三角形仍从外部结合膜，他们预期会形成囊泡包被DNA壳(VCDs)并释放到母囊泡腔内，有效创建具有DNA折纸内骨架的内体样区室。通过将挤出GVs通过200nm孔径过滤器制备LVs以促进cryoEM成像，将其与每侧携带一个胆固醇基团的三角形混合并触发壳组装。冷冻电镜直接成像显示VCDs作为紧密包裹二十面体壳的脂质囊泡位于各自母囊泡内。偶尔也观察到游离VCDs，推测由母囊泡破裂释放，以及DNA壳中存在类似于DCVs中发现的孔洞。

多囊泡壳结构

最后，研究人员通过结合向外和向内出芽反应，使用两面具有序列正交连接手柄的三角形，在两步过程中创建了双囊泡壳结构。首先，通过将chol-oligos杂交到三角形底面生产DCVs，并按前述方法与GVs混合。离心分离DCVs后，制备LVs并用与DCV外表面连接手柄互补的chol-oligos包被。将DCV浓缩物与这些LVs混合并在37°C孵育导致形成囊泡包被DCVs(VCDCVs)。与VCDs类似，VCDCVs通常被包裹在母囊泡内，作为提议出芽机制的结果。这些颗粒可被视为合成创建细胞器的简单示例，具有细胞质样区室（内囊泡）和周质样区室（外包膜与内脂膜之间的空隙）。二十面体DNA壳作为稳定机械骨架，为包含额外分子功能提供工程选项。

这项

这项研究证实了分子支架概念的普遍性，并确定出芽是DCV形成的基础过程。开发的DNA折纸膜出芽系统重述了网格蛋白介导的内吞作用(CME)关键方面，而不依赖细胞出芽机制组件。与网格蛋白类似，DNA折纸三角形作为分子支架，其自组装成笼状结构诱导膜变形并最终驱动囊泡形成。自由能由自组装过程提供，并通过胆固醇或生物素-中性亲和素连接传递到双分子层，模拟网格蛋白通过衔接蛋白与膜结合的方式。

使用DNA纳米结构报告的平均堆叠能量（-2.97 k_BT，T=300 K），研究人员估计二十面体组装（30个边缘，每个16个碱基堆叠相互作用）的自由能约为-1400 k_BT，八面体为-570 k_BT。这些估计超过将DOPC膜弯曲成球形囊泡的能量成本（460 k_BT，源自Helfrich理论E=8πk_C，其中k_C=18.3k_BT，298 K），支持实验观察结果。

与先前研究显示膜结合DNA折纸的高表面覆盖通常需要囊泡变形不同，该系统即使在低表面密度下也能诱导出芽，可能归因于DNA三角形的协同组装。这种模块化过程允许局部富集和逐渐膜弯曲，由组装自由能驱动而不需要全局覆盖。实际上，DCV形成发生在广泛的折纸-囊泡比率范围内，表明膜重塑更受局部组装动力学和扩散驱动相遇控制，而非总体密度。

网格蛋白笼和DNA折纸壳都展示结构灵活性，形成各种几何形状同时保持其支架功能。在脂质膜上组装时，DNA三角形明显从形成二十面体转变为八面体壳，受脂质组成和膜锚定类型等因素影响。类似多态行为已在由三角形亚基组成的DNA管中报道，其中环闭合期间的热波动被提议为一个原因，增加设计复杂性作为潜在解决方案。然而，在自由组装反应中，绝大多数形成的壳是二十面体，表明膜特性（如弯曲刚度）是 governing both壳几何形状和出芽效率的主要影响变量。

在一些DCVs上观察到的疤痕指向芽颈处的空间位阻，防止壳闭合。虽然这些缺陷原则上可以通过加入游离三角形修复，但效率取决于它们的可用性和组装状态。此处，在升高Mg²⁺浓度下游离三角形的组装可能导致寡聚体过大无法适应大多数DCVs的疤痕。然而，DCV出芽的快速动力学可能超过游离三角形寡聚化，允许它们并入DCVs，解释为什么只有子集展示疤痕。

该系统在各种脂质组成（包括天然脂质提取物）中展示稳健性能，快速动力学突出其多功能性和更广泛应用潜力。尽管如此，研究人员确定了完全由高熔点脂质（DPPC、DSPC）组成的膜中DCV形成受损的限制，以及在低渗条件下产量减少。这些约束可以用Helfrich哈密顿量解释，该量将膜变形的能量成本与双分子层的机械特性联系起来。凝胶相膜的更高弯曲刚度和低渗条件下增加的膜张力施加能量惩罚，直接影响DCV产量。虽然网格蛋白面临相同限制，生物膜利用细胞骨架使CME即使在高压膜张力下也能进行。未来工作可以探索主动颈收缩以克服当前系统限制。

总之，该研究提出了一个多功能平台，用于工程化具有可寻址内骨架或外骨架的受控大小囊泡。这种方法可以扩展至在出芽过程中封装目标分子，可能导致分子有效载荷应用。使用嵌套双囊泡结构，可以设计两种不同分子有效载荷同时但分开递送的场景。这项工作可能因此为靶向药物递送、疫苗开发和合成生物学中的创新应用铺平道路。在纳米尺度操纵膜动力学的潜力也为合成人工细胞和细胞器开辟了新视野，为研究人员寻求利用纳米技术力量用于实际和治疗目的提供宝贵工具。