Wadjet SMC马达通过360°旋转机制实现DNA拓扑捕获与环挤压的分子机制解析

本研究针对SMC复合物如何实现DNA加载这一关键科学问题，通过冷冻电镜技术解析了原核免疫系统Wadjet SMC马达在DNA加载过程中的三种关键状态结构。研究发现ATP水解驱动SMC二聚体围绕DNA进行近360°旋转，实现DNA在kleisin/KITE亚区室内的拓扑捕获，并揭示了环挤压起始于双马达单元尾对尾排列的DNA持有构象。该工作首次阐明了SMC马达进行拓扑DNA加载的分子机制，为理解环挤压的起始过程提供了重要理论基础。

　　

在生命科学的微观世界里，染色体结构维持蛋白（SMC）复合物扮演着分子工程师的角色，它们通过一种称为"环挤压"（loop extrusion）的精妙机制，将冗长的DNA分子折叠成高度有序的三维结构。这种过程对细胞分裂、DNA修复和基因表达调控至关重要。然而，在这些复合物开始环挤压之前，它们必须首先将DNA"加载"到自身结构中——就像一个缝纫机在开始缝纫前必须先穿线一样。尽管科学家们已经知道SMC复合物能够拓扑捕获DNA，但这一过程的具体分子机制一直是个未解之谜。

近年来发现的Wadjet系统为研究这一过程提供了独特视角。这种原核生物中的免疫系统利用SMC复合物来识别并切割入侵的质粒DNA，同时保护更大的染色体DNA。Wadjet系统通过环挤压机制扫描DNA，当检测到较小的环状质粒时，其JetD核酸酶亚基就会被激活，执行切割功能。然而，这一过程起始的分子细节——SMC马达如何加载到DNA上并做好环挤压准备——仍然不甚明了。

为了解决这一难题，来自瑞士洛桑大学的研究团队在《Molecular Cell》上发表了他们的最新研究成果。他们综合运用冷冻电镜结构分析、蛋白质工程和分子间交联等技术，成功捕获了Wadjet SMC复合物在DNA加载过程中的三个关键中间状态。

研究人员主要采用了冷冻电镜单颗粒分析技术确定蛋白质三维结构，利用蛋白质工程构建半胱氨酸突变体，通过分子交联技术调控SMC臂的开放程度，使用ATP酶活性分析评估突变体功能，并借助DNA切割实验验证复合物活性。这些技术的结合使得团队能够"冻结"并观察原本瞬时的加载中间状态。

DNA登载状态的结构特征

研究团队首先使用铍氟化物（BeF₃^-）抑制ATP水解，成功捕获了Wadjet的"DNA登载状态"。冷冻电镜结构显示，在这一ATP结合状态下，两个SMC马达单元并排排列在DNA双螺旋上，形成了一个开放的DNA加载门。SMC二聚体从静止状态的一侧重新定位到另一侧，暴露出原本被SMC头部阻塞的kleisin/KITE DNA结合位点。DNA被kleisin/KITE模块稳定结合，但尚未被拓扑捕获，SMC coiled-coil臂部分分离，打开了SMC核心腔。

SMC腔室限制对挤出-切割反应的影响

为了富集更难捕捉的半加载和全加载状态，研究人员开发了创新的"CysLocking"策略——通过在JetC coiled-coil上特定位置引入半胱氨酸对，并使用交联剂限制SMC腔室的开放程度。研究发现，位于肘部（elbow）的交联对质粒切割没有影响，而位于中部（middle）和连接处（joint）的交联则分别显著减缓和几乎完全阻断了切割反应。这表明SMC臂的充分开放对DNA环挤压至关重要，而部分开放足以支持DNA加载。

半加载状态揭示的旋转机制

利用中部交联的突变体，研究团队成功解析了"半加载状态"的结构。这一状态显示一个马达单元保持了DNA登载构象，而另一个则通过SMC颈门的关闭转变为了DNA持有构象。最令人惊讶的是，在DNA登载状态中位于DNA曲线外侧的SMC二聚体，在转变为持有构象后移动到了内侧，完成了DNA在kleisin/KITE区室内的拓扑捕获。

预挤压DNA加载状态的结构解析

从同一数据集中，团队还解析了"DNA加载状态"的结构，即环挤压前的最終准备状态。两个马达单元都采用了DNA持有构象，拓扑捕获了同一段DNA双螺旋，SMC颈界面关闭。马达单元呈尾对尾排列，SMC二聚体位于DNA曲线的内侧。颈门在DNA登载状态开放，而在DNA持有构象关闭，这一转变很可能是通过SMC二聚体围绕DNA旋转360°实现的。

预挤压与后挤压状态的比较

研究人员比较了预挤压（DNA加载状态）和后挤压（DNA切割状态）的结构，发现分离的马达单元结构非常相似，表明相似的DNA持有构象启动了并完成了质粒挤压。然而，二聚体几何结构存在显著差异：后挤压状态的马达单元沿着"下游DNA"（dnDNA，未挤压DNA）路径相互旋转靠近，这一重排伴随着kleisin/KITE模块通过两个JetA螺旋束的分离和旋转而重组。

研究结论与讨论部分强调，这项工作通过结构生物学方法首次揭示了SMC马达进行拓扑DNA加载的完整分子路径。研究发现ATP水解驱动SMC二聚体围绕DNA进行近360°旋转是实现拓扑捕获的关键步骤，这种复杂的构象变化可能反映了同时以特定方向将DNA加载到两个马达单元上的需求。

该研究还提出了从DNA捕获到环挤压的机制模型：在DNA加载状态，马达单元准备通过在其SMC coiled-coil之间捕获侧翼DNA片段来迈出环挤压的第一步。kleisin/KITE模块与SMC二聚体的特定排列通过（1）将DNA固定在SMC二聚体的一侧和（2）将dnDNA（未挤压）指向SMC区室，同时使"上游DNA"（upDNA，已挤压）远离它，从而确保了传输的方向性。

值得注意的是，尽管其静止状态架构不同，MukBEF和Wadjet却汇聚于共享的DNA登载状态，这表明DNA加载机制可能在进化上保守。Wadjet-I复合物中颈接口的不寻常组织——一个SMC马达单元的kleisin螺旋束主要与另一个马达单元的SMC蛋白的coiled-coil结合——可能代表了致力于细胞防御的SMC复合物的进化适应。

这项研究不仅阐明了Wadjet系统的工作原理，更为理解更广泛的SMC复合物家族（包括真核生物中的凝缩蛋白和粘连蛋白）的工作机制提供了重要见解。这些发现对开发针对SMC复合物功能异常相关疾病（如某些癌症和发育 disorders）的治疗策略具有潜在意义。