内源性Pfs230:Pfs48/45复合物与六种抗体的冷冻电镜结构揭示疟疾传播阻断活性的分子机制

本期推荐：为破解疟疾传播阻断疫苗靶点Pfs230:Pfs48/45复合物的分子组装难题，研究人员通过冷冻电镜解析了内源性复合物与六种强效抗体结合的结构，发现Pfs230 C端与Pfs48/45的互作模式及其对膜锚定的非必需性，揭示了抗体通过空间取向依赖的补体激活机制实现传播阻断，为下一代疫苗设计提供了蓝图。

　　

疟疾仍是全球最重大的公共卫生挑战之一，每年造成数十万人死亡，其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）导致的死亡病例占绝大多数。这种寄生虫通过按蚊在人群中高效传播，当蚊子吸食含有疟原虫配子体的人类血液后，配子体在蚊子中肠发育形成配子，最终完成有性生殖并产生具有感染性的子孢子。在这个传播瓶颈环节中，位于配子体表面的两个关键蛋白Pfs230和Pfs48/45成为阻断传播的核心靶点。它们都属于6-半胱氨酸（6-Cys）蛋白家族，能够形成异源二聚体复合物，但长期以来，由于缺乏高分辨率结构信息，这个复合物的精确组装方式、抗体作用机制以及疫苗设计思路都存在巨大空白。

为了解决这一难题，Bekkering、Yoo和Hailemariam等研究人员在《Immunity》杂志上发表了最新成果，他们成功解析了内源性Pfs230:Pfs48/45复合物与六种强效传播阻断抗体结合的冷冻电镜结构，分辨率最高达到3.4埃。这项研究不仅揭示了复合物的精细架构和相互作用界面，还意外发现膜锚定对蚊子传播并非必需，并阐明了抗体通过特定空间取向引发补体依赖的杀伤机制。

研究团队运用了多项关键技术：首先利用CRISPR/Cas9技术构建了C端带有3xFLAG标签的转基因寄生虫株（iGP2^230-tag），从体外培养的晚期配子体中通过亲和纯化获得天然复合物；采用蓝色原生胶电泳（BN-PAGE）和质谱分析验证复合物完整性；通过冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物与六种Fab片段（RUPA-97、LMIV230-01、2A2、18F25、RUPA-71、RUPA-44）结合的三维结构；借助表面等离子共振（SPR）分析抗体结合亲和力；利用悬浮免疫荧光和流式细胞术检测抗体在配子体表面的结合及补体沉积功能；通过标准膜喂养实验（SMFA）评估抗体在蚊子体内的传播阻断活性。

Cryo-EM structure of the Pfs230:Pfs48/45:6Fab complex

研究人员从转基因寄生虫株中纯化出内源性Pfs230:Pfs48/45复合物，质谱分析显示Pfs230和Pfs48/45是富集程度最高的蛋白。通过蓝色原生胶电泳发现复合物存在两种形态：一条带同时被α-Pfs230和α-Pfs48/45抗体识别，另一条带仅被α-Pfs230识别，分别对应Pfs230:Pfs48/45复合物和单独的Pfs230。与六种Fab片段孵育后，复合物在电泳中的迁移率发生改变，证实了抗体结合。冷冻电镜数据分析最终生成了四局部精修图谱：Pfs230D1-6与RUPA-97、LMIV230-01、2A2结合（3.6埃）、Pfs230D7-8与18F25结合（4.3埃）、Pfs230D9-14与Pfs48/45结合（4.7埃）、Pfs48/45与Pfs230D13-14、RUPA-71、RUPA-44结合（3.4埃），整体结构清晰地展示了所有组分的空间排布。

Insertion domains(IDs) organize Pfs230 domains

结构分析显示Pfs230由多个结构域簇组成，这些结构域通过插入域（IDs）介导的相互作用变得刚性。每个串联结构单元包含A型和B型6-Cys结构域，其中A型（如Pfs230 D1、D3、D5、D7、D9、D11、D13）呈现5-on-5β-三明治折叠，B型（如Pfs230 D2、D4、D6、D8、D10、D12、D14）呈现4-on-5β-三明治折叠。结构多样性主要体现在β链之间环区的长序列插入，即插入域（IDs），这些IDs存在于Pfs230D3、D6、D7、D10和D11中，其中多数（如Pfs230D3、D6、D10、D11-ID2）参与结构域间接触，从而介导刚性结构域簇的形成。

The Pfs230 C terminus interacts with Pfs48/45

高分辨率结构显示Pfs230通过其末端6-Cys结构域（D13和D14）与Pfs48/45的所有三个结构域相互作用，其中Pfs230D14贡献了大部分接触面积（1,477埃2）。复合物界面主要集中在Pfs48/45的盘状结构朝向膜外侧的一面，与GPI锚定位点相反。关键的相互作用由Pfs230 C末端（Cterm，残基3107-3122）介导，该区域占据Pfs48/45表面的一个沟槽，与Pfs48/45D1（残基45-48、65-75）、D2（环245-248）和D3（残基371-374、379-380）形成广泛接触。同时，Pfs48/45的N端缠绕在Pfs48/45D1-2周围，并通过残基38-50与Pfs230D14的环区（残基2993-2998、3107-3116）和β链（3011-3013）相互作用。体内实验进一步证实，缺失D13/14或C端的转基因寄生虫株虽然能正常表达截短蛋白，但无法将Pfs230锚定在膜上，然而这些突变体仍能有效感染蚊子，说明膜锚定对传播并非绝对必需。

RUPA-71 targets the highly conserved Pfs48/45D1-ii epitope

RUPA-71是一种靶向Pfs48/45D1的强效抗体（IC₈₀ < 10μg/mL），其结构与Pfs48/45D1的复合物显示，抗体主要与残基126-135相互作用，并通过盐桥和β片层氢键网络紧密结合。表位上的自然突变频率极低（<0.06%），是一个高度保守的中和位点。与另一种强效抗体RUPA-58相比，RUPA-71结合在相邻但部分重叠的表位，可能导致空间冲突。

Epitope 1a on Pfs48/45D3 is impeded in the Pfs230-bound state

结构比对发现，多数靶向Pfs48/45D1、D2和D3-1b表位的抗体在Pfs230结合状态下仍可接近，但靶向D3-1a表位的抗体（如TB31F、RUPA-29）会与Pfs230D13-14发生空间碰撞。然而，BN-PAGE实验表明这些抗体仍能部分结合复合物，且不会引起体内解离，提示Pfs48/45在复合物中可能保留一定灵活性，通过构象变化使某些表位在延伸构象中暴露。

Pfs230 membrane retention is non-essential for transmission

实验证明，抗体诱导的复合物解离能力与其传播阻断活性并不相关。例如，RUPA-57和RUPA-50都能在体外解离复合物，但效力相差悬殊（IC₈₀ > 100μg/mL vs <2μg/mL）。更重要的是，转基因寄生虫实验表明，即便Pfs230完全无法锚定在膜上（模拟抗体解离的最大效果），寄生虫仍能成功感染蚊子，且添加强效抗体2A2后无法抑制突变体的传播，充分说明复合物解离不是抗体发挥功能的主要机制。

Potent Pfs230D4 and D7 epitopes exhibit high and low degrees of sequence diversity, respectively

结构分析揭示了两个新的强效表位：2A2结合Pfs230D4（IC₈₀ = 1.9μg/mL），其表位呈现高度多态性，自然分离株中多个突变（如H1159D、Y1194S）能显著降低抗体结合；而18F25结合Pfs230D7（IC₈₀ < 30μg/mL），其表位极其保守，罕见突变（如D1803N、N1804D）对亲和力影响有限，是一个有潜力的疫苗靶点。

Potent Pfs230 antibodies target membrane distal epitopes

所有强效抗体（如RUPA-97、2A2、18F25）都结合在Pfs230的膜远端表面，且 approach 角度相似；而低效抗体（如RUPA-38）则结合在朝向Pfs48/45（即膜近端）的一面。功能实验证实，强效抗体能有效招募C1q并沉积C3，而低效抗体则不能，说明抗体的空间取向决定了其补体激活能力，进而影响传播阻断效力。

这项研究彻底改变了我们对Pfs230:Pfs48/45复合物的理解。结构生物学分析首次完整揭示了复合物的组装机制、抗体中和表位的空间分布以及作用模式。特别重要的是，研究发现膜锚定对寄生虫传播并非必需，否定了复合物解离作为抗体主要作用机制的假说，同时确立了抗体空间取向依赖的补体激活模型。这些发现不仅深化了对疟疾传播生物学的基础认识，还为下一代疫苗设计提供了关键指导：应聚焦于膜远端表面的保守表位（如Pfs230D7、Pfs48/45D1），采用结构导向的免疫原设计策略，将多个强效表位整合到单一免疫原中，以期激发更强大的传播阻断免疫反应。最终，这种基于精确结构信息的理性疫苗设计有望加速疟疾消除目标的实现。