靶向中性粒细胞亚群proBDNF：脓毒症生物标志物发现与线粒体过度活化机制新见解

本研究针对脓毒症免疫反应失调缺乏有效生物标志物和治疗靶点的临床难题，通过前瞻性多中心观察研究，首次发现CD16int中性粒细胞中proBDNF（脑源性神经营养因子前体）表达显著上调，且与SOFA评分、NLR等严重程度指标呈正相关。研究证实proBDNF通过调控GSK3β磷酸化介导线粒体膜电位升高和线粒体伸长，而中和抗体可逆转此现象，为脓毒症诊断和治疗提供了新的生物标志物和干预策略。

　　

在重症监护医学领域，脓毒症始终是导致患者死亡的主要原因之一，这种由感染引发的全身性免疫反应失调疾病，常常迅速进展为多器官功能衰竭。尽管医疗技术不断进步，但脓毒症的早期诊断和有效治疗仍是临床面临的重大挑战。当前缺乏能够准确反映疾病严重程度和预后的特异性生物标志物，同时针对免疫调节的治疗策略也相对有限。在这种背景下，科学家们将目光投向了中性粒细胞——这支免疫系统的"先头部队"，特别是其中不同功能亚群在脓毒症发生发展过程中的作用机制。

中性粒细胞根据CD16表达水平可分为CD16^hi成熟亚群和CD16^int幼稚亚群，这两个亚群在免疫功能方面表现出明显差异。更值得关注的是，近年来研究发现脑源性神经营养因子前体（proBDNF）不仅在中枢神经系统中发挥重要作用，还参与调节免疫炎症反应。然而，proBDNF是否在不同中性粒细胞亚群中具有差异性表达，以及这种表达与脓毒症严重程度之间存在何种关联，尚未有明确答案。

与此同时，线粒体作为细胞的能量工厂，其功能状态与免疫细胞活性密切相关。在脓毒症状态下，中性粒细胞线粒体可能出现功能异常，但这种异常是否具有亚群特异性，以及是否受到proBDNF信号的调控，这些都是值得深入探索的科学问题。解答这些问题不仅有助于理解脓毒症的发病机制，还可能为临床诊断和治疗提供新的思路。

在这项发表于《iScience》的研究中，研究人员开展了一项前瞻性多中心观察性研究，招募了脓毒症患者、非脓毒症患者和健康对照三个群体。通过多参数流式细胞术、免疫荧光、透射电镜等技术手段，系统分析了不同中性粒细胞亚群中proBDNF的表达特征，并探究了其与临床指标的相关性。同时，研究还通过体外实验探讨了proBDNF对线粒体功能和的调控作用及潜在机制。

研究采用了多项关键技术方法：通过多中心临床研究收集53例脓毒症患者、53例非脓毒症患者和53例健康对照的外周血样本；使用多参数流式细胞术（包括UMAP降维分析和FlowSOM聚类）检测白细胞亚群比例和proBDNF表达；采用流式分选技术分离CD16^hi和CD16^int中性粒细胞亚群；通过透射电镜观察线粒体超微结构变化；使用TMRE和MitoSOX荧光探针分别检测线粒体膜电位和活性氧水平；利用特异性中和抗体和重组蛋白进行功能干预实验。

ProBDNF expression in CD16int Neu was significantly increased during sepsis

研究人员首先通过流式细胞术分析了脓毒症患者和对照组外周血白细胞中proBDNF的表达情况。UMAP可视化分析显示，与其他白细胞群体相比，中性粒细胞表现出最高的proBDNF表达水平。进一步将中性粒细胞分为CD16^hi、CD16^int和CD16^neg三个亚群后发现，脓毒症患者CD16^int中性粒细胞比例显著增加。更重要的是，proBDNF表达呈现CD16依赖的梯度分布，其中CD16^int中性粒细胞中的proBDNF表达在脓毒症患者中显著上调，而CD16^hi中性粒细胞中仅轻微升高。这一发现通过免疫荧光分析得到了进一步验证。

ProBDNF expression in CD16int Neu is a potential diagnostic biomarker of sepsis

为了评估proBDNF表达的临床价值，研究人员构建了受试者工作特征曲线（ROC）。分析结果显示，CD16^int中性粒细胞中proBDNF中位荧光强度（MFI）对脓毒症诊断具有最高的价值，曲线下面积（AUC）为0.8407（健康对照）和0.7599（非脓毒症患者）。相关性分析表明，CD16^int中性粒细胞proBDNF MFI与脓毒症严重程度（SOFA评分）、炎症指标（NLR、MLR、PLR、白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白）、凝血功能（凝血酶原时间）、肝功能（直接胆红素、转氨酶）以及肾功能（尿素氮、肌酐）均呈正相关，而与淋巴细胞计数呈负相关。这些结果表明CD16^int中性粒细胞proBDNF表达可作为脓毒症有前景的生物标志物。

ProBDNF induced mitochondrial elongation in CD16hi Neu during sepsis

鉴于proBDNF信号在线粒体调控中的关键作用，研究人员通过透射电镜系统比较了脓毒症患者和对照组中性粒细胞亚群的超微结构变化。形态计量学分析显示，脓毒症与CD16^hi中性粒细胞平均线粒体长度增加相关，而CD16^int中性粒细胞中未观察到这种变化。使用proBDNF中和单克隆抗体（McAb-proB）处理可抑制脓毒症患者CD16^hi中性粒细胞中的线粒体伸长，表明proBDNF特异性诱导CD16^hi中性粒细胞线粒体形态改变。

ProBDNF increased the MMP of CD16hi Neu during sepsis

研究人员进一步评估了脓毒症患者和健康对照中性粒细胞的线粒体膜电位（MMP）和线粒体活性氧水平。使用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）和MitoSOX检测发现，与健康对照相比，脓毒症患者CD16^hi和CD16^int中性粒细胞的MMP均升高，而线粒体活性氧仅在CD16^int中性粒细胞中增加。功能实验表明，McAb-proB处理可限制脓毒症患者CD16^hi中性粒细胞TMRM的增加，而重组人proBDNF（rhProBDNF）蛋白处理可增加健康对照CD16^hi中性粒细胞的MMP。机制上，proBDNF信号影响糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的磷酸化，rhProBDNF处理特异性增加了CD16^hi中性粒细胞中Ser9位点磷酸化GSK3β（P(Ser9)-GSK3β）的表达。使用GSK3β活化抑制剂SB216763处理可显著增加中性粒细胞的MMP，进一步证实了该通路在调节线粒体功能中的重要性。

研究结论和讨论部分强调了本研究的重大学术价值和临床意义。研究发现脓毒症期间CD16^int中性粒细胞比例和proBDNF表达显著增加，且CD16^int中性粒细胞proBDNF MFI与脓毒症严重程度呈正相关，具有成为诊断生物标志物的潜力。与健康对照相比，脓毒症患者CD16^int和CD16^hi中性粒细胞的线粒体功能（MMP和MitoSOX）均出现过度活化，但仅在CD16^hi中性粒细胞中观察到线粒体伸长现象。使用McAb-proB中和抗体可 attenuate脓毒症期间CD16^hi中性粒细胞的MMP和线粒体长度。

这些发现不仅为理解脓毒症免疫病理机制提供了新视角，也为临床诊断和治疗提供了新的方向。proBDNF在CD16^int中性粒细胞中的表达作为脓毒症生物标志物，具有较高的诊断和预后价值，其与多个器官功能指标的关联性表明它可能参与多器官功能障碍的发病过程。特别值得注意的是，proBDNF通过调控GSK3β磷酸化途径，特异性调节CD16^hi中性粒细胞的MMP和形态，这为开发针对性的治疗策略提供了分子基础。

靶向proBDNF以逆转CD16^hi中性粒细胞线粒体活化状态，可能抑制与脓毒症相关的效应通路，为脓毒症患者提供潜在的治疗方法。未来研究应进一步探索proBDNF促进中性粒细胞线粒体过度活化的详细机制，并在更大型的临床队列中验证其生物标志物价值，同时考虑各种潜在混杂因素的影响，以推动这一发现向临床应用的转化。