SHH1与DNA甲基化阅读器MBD7协同抑制拟南芥启动子甲基化基因的转录沉默

本研究揭示了拟南芥中SHH1通过与DNA甲基化阅读器MBD7形成复合物，协同识别H3K9me2组蛋白标记和甲基化DNA，从而抑制启动子甲基化基因的转录沉默。该发现阐明了植物在维持表观遗传平衡中的新型调控机制，为理解DNA甲基化在基因表达中的双重角色提供了重要见解。

　　

在植物基因组中，DNA甲基化是一种高度保守的表观遗传修饰，通常与转录基因沉默（TGS）密切相关，特别是在转座子（TEs）和重复序列区域。然而，有趣的是，启动子区域的DNA甲基化并不总是导致基因沉默，这表明存在特定的反沉默机制来抵消甲基化的抑制效应。此前的研究已发现两个DNA甲基化阅读器复合物——SUVH1/3-DNAJ1/2和MBD7-ACD（Alpha Crystallin Domain），它们能够促进甲基化基因的表达，但MBD7复合物如何有效靶向甲基化位点的机制尚不清楚。这引出了一个关键问题：在DNA甲基化常与抑制性组蛋白标记H3K9me2共定位的染色质环境中，MBD7复合物是如何克服这些障碍并结合到甲基化位点的？

为了解答这一问题，研究人员在《Plant Communications》上发表了他们的最新发现。他们通过正向遗传学筛选，在拟南芥中鉴定出SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOG 1（SHH1，也称为DTF1）是MBD7复合物的一个新组分。SHH1是一个植物特异性蛋白，其C端的SAWADEE结构域能够识别H3K9me2标记。本研究揭示了SHH1的一个新颖功能：它超越了其在经典RNA导向的DNA甲基化（RdDM）途径中的角色，与MBD7协同工作，形成一个动态的、相互增强的结合模块，共同促进启动子甲基化基因的表达，而不显著改变其DNA甲基化状态。

研究团队运用了多种关键技术方法来验证他们的假设。这些方法包括：利用EMS诱变和基于图谱的克隆进行正向遗传学筛选以鉴定突变体；通过CRISPR/Cas9技术构建基因敲除突变体（如shh2突变体）；使用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）分析DNA甲基化模式；通过mRNA测序（mRNA-seq）进行转录组分析以鉴定差异表达基因；采用酵母双杂交（Y2H）、分裂荧光素酶互补 assay（Split-Luc）、GST pull-down和共免疫沉淀（Co-IP）等技术验证蛋白质间的物理相互作用；通过染色质免疫沉淀 followed by quantitative PCR（ChIP-qPCR）分析组蛋白修饰（如H3K9me2）和蛋白质在染色质上的富集情况；利用免疫荧光显微镜观察蛋白质的亚细胞共定位；以及通过RT-qPCR进行基因表达定量分析。实验材料主要来源于拟南芥的转基因报告株系（如YJ系）和突变体，以及从成熟种子中分离的胚胎组织。

研究结果通过一系列严谨的实验逐步展开：

SHH1是抑制YJ报告基因转录沉默所必需的

研究人员从一个EMS诱变的YJ报告株系（该株系在rdr6-11背景下表达由易受表观调控的双花椰菜花叶病毒35S启动子（d35S）驱动的荧光素酶（LUC））中，分离出一个新的隐性突变体YJshh1-2，其LUC表达显著降低。遗传互补实验证实SHH1是LUC表达所必需的。值得注意的是，其同源物SHH2的突变并未产生相同表型，揭示了功能特异性。用DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-dC）处理可恢复YJshh1-2中的LUC表达，表明SHH1的功能依赖于DNA甲基化通路。

SHH1功能障碍导致YJ报告基因CHH甲基化和H3K9me2水平降低

与SHH1在RdDM中的已知作用一致，全基因组甲基化测序显示YJshh1-2突变体中d35S启动子的CHH甲基化水平显著降低（约40%），H3K9me2水平也显著减少。然而，这种表观标记的减少与LUC表达的抑制相矛盾，暗示SHH1在YJ转基因位点上扮演着超越RdDM的反沉默角色。McrBC-PCR分析表明总体DNA甲基化水平变化不大。

SHH1与MBD7在同一遗传通路中发挥作用以抑制YJ转基因和部分内源基因的转录沉默

遗传学分析表明，YJshh1-2 mbd7-4和YJshh1-2 lil-1双突变体在LUC沉默上没有表现出加性效应，而YJshh1-2 suvh1-1则有，这表明SHH1通过MBD7-ACD通路发挥作用。对胚胎的mRNA-seq分析发现，在YJshh1-2和YJmbd7-4突变体中，有927个基因共同下调。这些基因的启动子甲基化水平并未增加，且它们在YJshh1-2 mbd7-4双突变体中的表达与单突变体相似，进一步支持了SHH1和MBD7处于同一通路的概念。

SHH1与MBD7体内相互作用

酵母双杂交、分裂荧光素酶、Pull-down和Co-IP实验均证实SHH1与MBD7存在直接的物理相互作用。结构域映射表明，SHH1的SAWADEE结构域和MBD7的MBD结构域对相互作用至关重要。SAWADEE结构域中的点突变（Y140A, Y212A）——已知会破坏H3K9me2结合——会 abolishes 与MBD7的相互作用，而同源域突变（K72A）则无影响。外源添加H3K9me2肽段并不影响SHH1-MBD7的相互作用，表明其结合不依赖于H3K9me2，但SAWADEE结构域的完整性对其构象和相互作用能力至关重要。

SHH1与MBD7共定位并对MBD7的定位和稳定性至关重要

免疫荧光显示SHH1和MBD7在细胞核中共定位，特别是在核仁和核质焦点中。在YJshh1-2突变体背景中，MBD7的蛋白水平显著降低，其正常的核内定位模式（核仁和核质焦点）在大多数细胞中丢失，这表明SHH1对于MBD7的稳定性和正确的亚核定位是必需的。

SAWADEE结构域对SHH1的功能至关重要

功能互补实验表明，SAWADEE结构域的点突变（Y140A, Y212A）无法挽救YJshh1-2突变体的LUC表达缺陷和部分内源基因（如AT3G30460, AT5G05250, AT5G33395）的表达下调，而同源域突变（K72A）则可以。ChIP-qPCR分析进一步揭示，Y140A和Y212A突变体严重损害了SHH1本身在甲基化位点（d35S启动子和内源基因启动子）的结合能力。

SHH1和MBD7在靶向甲基化位点中具有相互依赖的作用

ChIP实验表明，在YJshh1-2突变体或表达SHH1Y140A/Y212A的植物中，MBD7在靶位点的富集显著降低。反之，在YJmbd7-4突变体中，SHH1的富集也显著减少。这证明SHH1和MBD7在招募彼此到甲基化染色质位点上存在协同作用，它们的结合是相互依赖的。

综上所述，本研究得出了结论：SHH1与MBD7形成了一种新型的、协同作用的复合物。SHH1通过其SAWADEE结构域识别H3K9me2，而MBD7通过其MBD结构域识别甲基化的DNA。这种对“DNA甲基化-H3K9me2”双重标记的协同识别，使得SHH1-MBD7模块能够有效结合到带有抑制性表观标记的染色质上，从而招募ACD蛋白（如LIL和ROS5）并促进启动子甲基化基因的表达，抵消转录沉默。这项工作揭示了SHH1在RdDM途径之外的一个关键新功能，并阐明了一种精妙的机制，通过该机制，植物利用同一个蛋白（SHH1）在不同的复合物语境中（与Pol IV或与MBD7）来分别建立或对抗DNA甲基化介导的沉默，从而精细地平衡表观遗传状态以调控基因表达。这种机制可能对植物适应环境变化和稳定转基因性状具有重要意义。