利用感染感应型微型基因组靶向埃博拉病毒复制机制的新型分子治疗策略

本研究针对埃博拉病毒(EBOV)治疗中特异性不足和耐药性问题，开发了一种基于负链RNA微型基因组(MG)的分子治疗平台。该平台利用病毒自身蛋白在感染细胞内特异性表达抗病毒转基因（抗VP24 shRNA和RBBP6549-571肽段），实验证明其可抑制50%以上病毒复制，为开发精准抗病毒疗法提供了新思路。

　　

埃博拉病毒(EBOV)作为丝状病毒科的代表性病原体，曾引发2014-2016年西非大规模疫情，导致超过28,000人感染和11,000人死亡。这种负链RNA病毒通过编码核蛋白(NP)、聚合酶辅因子(VP35)、基质蛋白(VP40)、糖蛋白(GP)、转录激活因子(VP30)、包装因子(VP24)和RNA依赖的RNA聚合酶(L)等7种结构蛋白，在宿主细胞内完成复制周期。当前临床采用的小分子药物存在脱靶效应和耐药性风险，单克隆抗体生产成本高昂且半衰期短，而获批疫苗ERVEBO存在病毒脱落和不良反应等问题。因此，开发能够精准靶向感染细胞、具有自我放大特性且安全性高的新型治疗策略迫在眉睫。

本研究创新性地提出"治疗性微型基因组"(therapeutic minigenome)概念，通过将治疗性转基因 flanked by EBOV基因组3'前导序列和5'尾随序列，构建出仅在病毒感染细胞内才能被激活的智能表达系统。该系统利用病毒自身蛋白完成转录、复制和包装过程，实现治疗基因的特异性表达和放大效应，而对健康细胞保持"沉默"，显著提高了治疗安全性。

研究人员主要采用以下关键技术方法：1) 利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录(IVT)制备微型基因组RNA；2) 构建四顺反子微型基因组(4cis-MG)作为EBOV替代病毒模型；3) 建立转录/复制 competent病毒样颗粒(trVLPs)生产系统；4) 通过双荧光素酶报告系统验证基因沉默效果；5) 采用RT-qPCR和Western blot分别定量病毒RNA和蛋白表达水平。

Scheme of therapeutic MG targeting EBOV

研究人员设计了一种负链取向的治疗性微型基因组，其包含病毒复制、转录和包装所必需的3'前导和5'尾随序列。在EBOV感染情况下，病毒RNP复合体蛋白（NP、VP35、VP30和L）可识别这些序列并启动治疗性MG的复制和转录，新合成的MG RNA随后被VP24压缩并通过VP40包装成trVLPs。这些携带治疗基因的trVLPs表面展示EBOV GP蛋白，能够感染新的靶细胞，建立治疗药物的自我递送机制。

Expression of 1cis-MG-anti-VP24 and silencing of VP24

通过设计靶向VP24的shRNA序列，两侧 flanked by 前体tRNA(pre-tRNA)序列，使其能够被RNase P和Z切割处理，最终经Dicer加工生成特异性siRNA。双荧光素酶实验显示，合成anti-VP24 siRNA可降低60%荧光素酶活性，而1cis-MG-anti-VP24质粒在EBOV RNP蛋白存在下也能实现20%的抑制效果，证明负链MG RNA可有效表达具有序列特异性的siRNA。

IVT 1cis-MG-anti-VP24 RNA

体外转录制备的1cis-MG-anti-VP24 RNA在琼脂糖凝胶电泳中显示预期大小条带。RT-qPCR分析表明，当与RNP蛋白表达质粒共转染293细胞后，MG RNA拷贝数在6-24小时内显著增加，证实治疗性MG RNA在病毒蛋白存在下能够有效复制。

1cis-MG-anti-VP24 inhibits the replication and transcription of 4cis-MG

使用4cis-MG作为替代病毒模型，发现1cis-MG-anti-VP24可显著降低VP24 mRNA水平和4cis-MG vRNA水平。在感染实验中，与对照MG相比，1cis-MG-anti-VP24使纳米荧光素酶(nLuc)报告信号降低60%，VP40蛋白表达也相应减少，证明通过靶向VP24可选择性抑制感染性EBOV产生，而不影响治疗性1cis-MG的包装。

Development of a therapeutic MG encoding a host antiviral protein-derived peptide

研究人员进一步开发了表达宿主抗病毒蛋白RBBP6衍生肽段(RBBP6_549-571)的治疗性MG。该肽段可通过破坏EBOV NP与VP30蛋白相互作用抑制病毒RNA合成。将RBBP6_549-571与mGreenLantern(mGL)荧光蛋白融合，构建了1cis-MG-RBBP6_549-571-mGL载体。

Production and analysis of 1cis-MG trVLP

通过共转染所有7种EBOV蛋白表达质粒和1cis-MG质粒，成功生产出携带治疗性MG的trVLPs。银染和Western blot证实trVLPs中含有GP和VP40蛋白，蛋白酶保护实验证明GP完整展示在颗粒表面，表明病毒颗粒具有良好的完整性。

Therapeutic MG RBBP6_549-571 trVLPs inhibit surrogate virus genome replication, transcription, and production of infectious particles

用治疗性trVLPs处理已转染4cis-MG和辅助蛋白的293细胞，发现1cis-MG-RBBP6_549-571-mGL trVLPs可使nLuc活性降低50%以上。随着传代次数增加(P2-P4)，抑制效果逐渐增强，到P4代时达到90%抑制率。Western blot显示VP40表达量相应下降，荧光成像显示治疗组mGL信号随传代逐渐减弱，而对照组信号增强，表明治疗性MG可有效抑制替代病毒复制。

本研究证实了治疗性微型基因组作为感染感应型抗病毒平台的巨大潜力。该平台具有三大突出优势：一是特异性，仅在病毒感染细胞内激活，避免对健康细胞的影响；二是放大性，能利用病毒复制机器自我扩增，提高治疗效果；三是广谱性，通过切换启动子和包装信号，可适配不同丝状病毒。靶向VP24的shRNA和RBBP6_549-571肽段均表现出显著抗病毒效果，其中VP24作为所有埃博拉病毒种的干扰素拮抗剂，而RBBP6靶向的NP蛋白PPxPxY基序在所有丝状病毒中保守，使这两种治疗策略具备成为泛丝状病毒治疗药物的潜力。

该技术平台不仅为埃博拉病毒治疗提供了新思路，其模块化设计理念也可扩展至其他RNA病毒（正链和负链）甚至DNA病毒的治疗中。通过负载不同治疗基因（如靶向宿主致病反应的基因），该平台有望发展成为应对新发病毒感染的通用治疗策略，显著提升人类应对病毒性传染病的防控能力。