靶向RALGEF的小分子抑制剂：抑制RAS驱动胰腺癌及转移的新策略

本刊推荐：为解决RAS驱动肿瘤治疗难题，研究人员聚焦于靶向RAS下游效应分子RALGEF的开发。通过计算机模拟筛选和药物化学优化，首次发现可特异性抑制RAS/RAL信号通路的小分子pan-RALGEF抑制剂，在体外和体内实验中显著抑制胰腺癌生长和转移，为RAS驱动肿瘤治疗提供了新途径。

　　

在癌症研究领域，RAS癌蛋白堪称"最难攻克的堡垒"。作为人类癌症中最常被激活的癌蛋白，RAS突变发生在约30%的恶性肿瘤中，在胰腺癌中这一比例更是高达90%以上。尽管科学界经过数十年的努力，直接靶向RAS的抑制剂开发却一直进展缓慢，直到最近才有少数针对特定RAS突变体（如KRAS^G12C）的抑制剂获得批准。然而，这些药物仍然面临耐药性快速产生的严峻挑战。

传统的靶向治疗策略转向了间接抑制RAS的途径，即靶向其下游效应分子。RAS主要通过三条关键信号通路发挥作用：RAF激酶、PI3K（磷酸肌醇3激酶）和RALGEF（Ras-like GTP酶交换因子）。虽然已有FDA批准的RAF和PI3K抑制剂，但它们在临床中的疗效相当有限。而第三条通路——RALGEF/RAL通路——尽管在RAS驱动的肿瘤发生和转移中起着关键作用，却长期以来被相对忽视。

越来越多的证据表明，RALGEF/RAL通路在RAS介导的体内转化效应中扮演着关键角色。研究表明，敲低RALA虽然对正常二维细胞生长没有影响，却能显著抑制胰腺癌细胞系在软琼脂中的三维生长和异种移植肿瘤的形成。类似地，RALGEF家族成员RGL2的抑制也能产生相同效果。更重要的是，RALA和RALB对于体内转移过程都至关重要。基因敲除研究进一步证实，RALGDS敲除小鼠能够抵抗RAS诱导的转化，而RALA敲除小鼠则对RAS诱导的肺肿瘤发生具有极强的抵抗能力。

正是在这样的背景下，来自路易斯维尔大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项突破性研究，报道了首个具有抗肿瘤活性的小分子pan-RALGEF抑制剂，为RAS驱动肿瘤的治疗提供了新的希望。

研究人员主要运用了计算机虚拟筛选、药物化学优化、三维细胞培养技术、蛋白质相互作用分析、动物异种移植模型等关键技术方法。其中患者来源异种移植(PDX)模型使用了Jackson实验室提供的J000096053样本。

Identification of RALGEF inhibitor

通过计算机模拟筛选，研究人员以RALGDS的RA结构域为靶点，从130万个化合物中筛选出前96个候选分子。利用RALGEF抑制可阻断三维生长但不影响二维生长的特性，他们在多种RAS驱动的胰腺癌细胞系（包括MIA PaCa-2和PANC-1）中进行了软琼脂生长抑制筛选。结果表明，多个化合物表现出活性，其中效果最好的被命名为C4。定量分析显示，C4在携带KRAS突变的胰腺癌细胞系中的IC₅₀值小于1μM，而在二维培养中相同浓度下对细胞生长没有影响。在野生型RAS的BRAF突变黑色素瘤细胞系A375中，该化合物在二维和三维条件下均无效果，证明了其对KRAS的特异性。

Inhibition of RAS/RALGEF signaling by C4

为了验证C4对RAS/RALGEF信号通路的抑制作用，研究人员检测了其对内源性RAL激活水平的影响。使用商业化的RAL活性检测试剂盒，他们发现短暂处理（1小时）C4能显著抑制MIA PaCa-2和PANC-1细胞中内源性活性RAL（GTP结合形式）的水平，这表明C4确实能够有效抑制RALGEF/RAL信号通路。

Identification of an enhanced activity derivative of C4

通过多轮药物化学优化和软琼脂筛选，研究团队合成了超过170个C4衍生物，最终开发出化合物C4-180，其生物学活性较母体化合物C4显著增强。RAL活性下拉实验证实，C4-180在抑制RAL活性方面比C4更有效。同时，这些化合物对MAPK和PI3K信号通路没有影响，表明它们对RALGEFs具有特异性。

Direct binding C4-180 with RALGDS

通过分析超速离心(AUC)实验，研究人员证实C4-180能直接与全长RALGDS重组蛋白结合，预测解离常数(k_d)约为1μM。使用微量热泳动(MST)技术对RALGDS的RA结构域进行检测，获得了低μM级的结合亲和力。为了解决溶解度问题，团队开发了C4-180的一系列溶解度优化衍生物，其中溶解度最好的C4-116在MST实验中的平均k_d为1.9μM。

Inhibition of RAS/RALGEF binding

研究表明，C4-180能有效抑制RAS与RALGDS、RGL2和RGL3的相互作用，但对RGL1的作用因结合太弱而难以量化。这表明C4-180是首个pan-RALGEF抑制剂，能够同时作用于多个RALGEF家族成员。

Molecular modeling predicts how C4-180 binds RALGEFS and explains RALGEF RA domain specificity

通过分子建模和对接分析，研究人员预测了C4-180与RALGDS RA结构域的结合方式，发现其主要与TYR814和SER816等残基相互作用。这些残基在RALGEF同源物中保守，但在RAS效应分子NORE1A (RASSF5)中不保守，这解释了化合物的pan-RALGEF抑制效果和特异性。实验证实C4-180对RAS与NORE1A的相互作用几乎没有影响。

In vivo anti-tumor activity of C40-180

体内实验显示，C4-180能显著抑制MIA PaCa-2异种移植瘤的生长。在更严格的胰腺癌PDX模型中，C4-180治疗也导致了统计学上显著的肿瘤生长减少。更重要的是，在转移实验中，C4处理显著减少了肺部转移灶的数量，证明该化合物能抑制肿瘤的转移过程。

Comparison of C4-180 efficacy against RAL activation to that of FDA approved K-RAS 12C RAS inhibitor Sotorasib and pan-RAS inhibitor RMC-7977

与FDA批准的KRAS^G12C抑制剂Sotorasib (AMG-510)和pan-RAS抑制剂RMC-7977相比，C4-180能有效抑制RAL激活，而这些直接RAS抑制剂虽然能完全抑制MAPK通路，但对RAL通路的效果不佳甚至没有效果。

研究结论和讨论部分强调，这项研究首次报道了具有抗肿瘤活性的pan-RALGEF小分子抑制剂。这些化合物能够在体外抑制三维细胞生长，在体内抑制肿瘤发生和转移，且没有明显毒性，这与之前的遗传学研究预测一致。RALGDS通路因此被证明是一个有效且可靶向的治疗途径。

尽管直接RAS抑制剂如Sotorasib和Adagrasib已在临床中取得一定成功，但它们仅针对KRAS^G12C突变体，且耐药性问题严重。更重要的是，这些药物以及其他pan-RAS抑制剂如RMC-7977，在实验系统中对RALGDS通路的效果不佳。因此，RALGEF抑制剂可能与新型RAS抑制剂联合使用，通过完全抑制RAS通路来防止耐药性的产生。

这项研究的重要意义在于开辟了一条新的RAS靶向治疗途径，为RAS驱动肿瘤（特别是胰腺癌）的治疗提供了新的策略。RALGEF抑制剂的独特机制——抑制转化表型而不影响正常生长——使其成为一个理想的抗癌靶点。未来研究将探索这些抑制剂与现有RAS抑制剂的联合使用效果，以及它们在更多类型RAS驱动肿瘤中的应用潜力。