RAF亚型（ARAF、BRAF、CRAF）激酶的特性表征与抑制剂敏感性分析

本研究系统比较了13种I型、I.5型和II型RAF抑制剂对三种RAF亚型的抑制效能，发现II型抑制剂对CRAF具有显著选择性，而I型抑制剂SB590885呈现广谱抑制特性。研究人员通过生化表征和晶体结构解析，揭示了PLX4720在CRAF二聚体中的不对称结合模式，为开发亚型选择性RAF抑制剂提供了重要理论依据，对精准治疗RAF通路异常相关癌症具有重要指导意义。

　　

在癌症研究的浩瀚星海中，RAS-RAF-MEK-ERK信号通路犹如一条繁忙的信息高速公路，控制着细胞的生长和增殖。当这条通路发生故障时，往往会导致癌症的发生。其中，BRAF基因的V600E突变尤为著名，它是恶性黑色素瘤、甲状腺乳头状癌等多种恶性肿瘤的主要驱动因素。相比之下，ARAF和CRAF这两种RAF亚型的活化突变虽然较为罕见，但也在多种癌症中被发现。

面对这些异常激活的RAF激酶，科学家们开发了多种抑制剂，主要分为三种类型：I型、I.5型和II型。这些抑制剂就像精准的钥匙，试图锁住异常活跃的RAF激酶。特别是针对BRAF^V600E的I.5型抑制剂，如vemurafenib、dabrafenib和encorafenib，已经在临床治疗中取得了显著成功。然而，这些抑制剂存在一个令人困扰的现象——" paradoxical activation"（ paradoxical activation），即在低浓度下反而会激活野生型RAF，导致ERK信号通路上调，这不仅限制了治疗效果，还可能引发皮肤病变等副作用。

更复杂的是，RAF激酶有三种亚型（ARAF、BRAF和CRAF），它们之间既有相似性又有差异性。虽然这些激酶的ATP结合位点序列高度保守（约75-80%相同），但研究发现CRAF在KRAS驱动的肿瘤发生中具有独特作用，而ARAF的激活则与对某些抑制剂（如belvarafenib）的耐药性有关。因此，了解不同抑制剂对这三种RAF亚型的抑制效力和选择性，对于开发更精准、更有效的治疗策略至关重要。

尽管已有一些研究探讨了RAF抑制剂的特性，但迄今为止还没有研究系统性地比较各类抑制剂对三种RAF亚型的抑制效力。正是为了填补这一空白，Dana-Farber癌症研究所的研究团队开展了这项深入研究，他们的研究成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

研究人员运用了多种关键技术方法：通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备了单体和二聚体的RAF激酶复合物；采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术测定激酶活性和抑制剂效能；通过酶动力学分析测定了各种RAF构建体的K_m[ATP]和K_m[MEK]值；利用X射线晶体学解析了CRAF与PLX4720的复合物结构（分辨率为2.91?和3.50?）。

Characterization of dimeric and monomeric ARAF, BRAF, and CRAF complexes

研究人员成功制备了14-3-3结合的二聚体RAF复合物和单体RAF:MEK复合物。二聚体复合物包括ARAF^SSDD、BRAF^WT、CRAF^WT和CRAF^SSDD，其中BRAF和CRAF^SSDD复合物表现出较高的催化活性，而ARAF^SSDD和CRAF^WT活性相对较低。单体RAF复合物（去除C端14-3-3结合位点）包括ARAF^KD、ARAF^KD,SSDD、BRAF^KD、BRAF^V600E、CRAF^KD和CRAF^KD,SSDD，这些复合物基本没有激酶活性，但BRAF^V600E例外，其活性与二聚体RAF相当。

酶动力学分析显示，所有测试的RAF蛋白都表现出明显的底物抑制现象。二聚体RAF复合物的K_m[ATP]值接近1μM，而抑制相的表观K_i值在毫摩尔范围内且变异性较大。MEK的米氏常数在30-150nM范围内，CRAF^WT与CRAF^SSDD以及BRAF^WT与BRAF^V600E之间的K_m[MEK]值没有显著差异。

Potency and selectivity of diverse RAF inhibitors across RAF isoforms

研究人员测试了13种RAF抑制剂对二聚体RAF复合物和单体BRAF^V600E的抑制效力。I型抑制剂SB590885对所有RAF亚型都表现出较强的抑制活性（IC₅₀范围2.5-15nM），是测试的抑制剂中最具广谱性的。而另一种I型抑制剂GDC0879的效力较差，对某些RAF亚型的IC₅₀超过500nM。

四种I.5型抑制剂都对单体BRAF^V600E有较强抑制活性，这与预期一致，因为I.5型结合模式与二聚化激活RAF时促进的αC-螺旋向内构象相拮抗。令人意外的是，dabrafenib对RAF二聚体也表现出显著活性（对ARAF、BRAF和CRAF的IC₅₀分别为9nM、9nM和19nM）。

II型抑制剂作为一类，对CRAF的抑制效力最强，而对ARAF相对较弱。所有测试的II型化合物对CRAF二聚体的抑制效力至少比对ARAF二聚体强10倍，其中naporafenib对CRAF的效力比对ARAF强约30倍。AZ628、belvarafenib和LY3009120对CRAF^WT和CRAF^SSDD都表现出个位数纳摩尔级的效力。

另一个共同特征是II型抑制剂对BRAF和CRAF^SSDD二聚体的抑制表现出明显的正协同性，这体现在剂量反应曲线的陡峭斜率和四参数拟合得到的Hill常数上。有趣的是，尽管这些抑制剂对CRAF^WT和CRAF^SSDD的效力非常一致，但对CRAF^WT二聚体的正协同性明显减弱或完全消失。

BRAF inhibition by type II inhibitors is insensitive to ATP concentration

研究人员在10μM、100μM和1000μM ATP浓度下测试了 selected化合物对BRAF^WT二聚体的抑制效力。I型抑制剂SB590885和I.5型抑制剂PLX8394的IC₅₀值随ATP浓度增加而变化，符合预期。相比之下，II型抑制剂tovorafenib、naporafenib、AZ628和belvarafenib的IC₅₀值仅受ATP浓度增加的 modest影响。

这种表现令人惊讶，因为II型抑制剂显然是ATP竞争性的，它们占据ATP结合裂隙，且它们诱导的DFG-out构象与ATP结合不兼容。研究人员推测这种表观非竞争性行为源于II型结合模式，也可能与抑制剂对BRAF二聚体结合的协同性有关。

Crystal structure of CRAF in complex with PLX4720

研究人员解析了CRAF与I.5型抑制剂PLX4720的复合物晶体结构，这是首个CRAF与I.5型抑制剂的结构。该结构显示CRAF形成背对背二聚体，MEK1以面对面方向与每个CRAF激酶结构域结合，与之前看到的MEK1结合状态BRAF和CRAF复合物类似。

与之前的CRAF₂MEK₂异源四聚体结构不同，该结构中只有一个CRAF原体采用活性αC-螺旋向内构象。在另一个原体中，PLX4720以与非活性αC-螺旋向外构象结合，这与相关I.5型抑制剂与BRAF结合时观察到的情况基本相同。

值得注意的是，CRAF中的K431在BRAF和ARAF中都是组氨酸。虽然不直接与抑制剂接触，但其εN与PLX4720上的氯取代基距离约4.5?。考虑到最近对赖氨酸残基共价靶向的兴趣，CRAF的这一独特特征可能为开发CRAF选择性制剂提供有吸引力的途径。

Concluding Remarks

这项研究提供了对RAF抑制剂亚型选择性的新理解，对精准肿瘤治疗具有重要意义。研究发现，II型抑制剂通常被认为"pan-RAF"抑制剂，但实际上它们对CRAF的抑制效力最强，而对ARAF相对较弱。相反，I型抑制剂SB590885对所有RAF亚型都表现出相对均衡的抑制效力。

这些结果也对理解RAF抑制剂的 paradoxical activation机制具有重要意义。prevailing模型认为，抑制剂结合到RAF二聚体的一个原体会在第二个原体中产生活性但耐药的构象，这意味着抑制剂结合的负协同性，并解释了为什么抑制剂诱导的二聚体仍然可以保持活性。CRAF与PLX4720的结构通过将其扩展到CRAF进一步确立了该模型对I.5型抑制剂的合理性。

然而，研究结果也对该模型的普遍性提出了质疑。II型RAF抑制剂也已知促进RAF二聚化并表现出 paradoxical ERK通路激活，但研究结果显示它们以明显的正协同性而非负协同性抑制RAF二聚体。

总之，这项研究不仅提供了对当前RAF抑制剂药理学的重要见解，还将为开发具有独特亚型选择性的新制剂提供信息，最终实现更精准、更有效的癌症治疗策略。