内质网分子伴侣HSP90.7的pre-N与CTE区域调控植物蛋白稳态与逆境适应的分子机制

本研究聚焦植物内质网定位的分子伴侣HSP90.7，通过分子动力学模拟、体外生化实验与体内突变体分析，系统解析其pre-N与C末端延伸区（CTE）在维持蛋白稳态与逆境响应中的关键作用。研究发现，缺失这两个区域虽不影响正常发育，但导致植株对内质网应激极度敏感；pre-N缺失增强ATP酶活性，而CTE缺失削弱分子伴侣的holdase功能。该研究揭示了HSP90.7在植物应对环境胁迫中的精细调控机制，为作物抗逆育种提供新靶点。

　　

在真核细胞中，内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）是蛋白质合成、折叠与质量控制的核心场所，其稳态维持对细胞存活至关重要。当细胞遭遇逆境胁迫时，内质网中容易累积错误折叠的蛋白质，从而引发内质网应激（ER Stress）及未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）。在这一过程中，内质网定位的热休克蛋白90家族成员（如HSP90.7在拟南芥中，亦称为SHEPHERD）扮演了关键角色。它们通过协助客户蛋白（client proteins）的正确折叠与成熟，维护细胞的蛋白稳态（proteostasis）。尽管HSP90蛋白在进化上高度保守，但其不同亚型因细胞定位与微环境差异而具有独特的功能特性。尤其是位于内质网中的HSP90成员（在哺乳动物中为GRP94，在植物中为HSP90.7），其分子机制与调控方式仍有许多未知。

以往的研究表明，HSP90.7对植物正常发育与胁迫响应均具有重要作用。例如，HSP90.7功能缺失会导致干细胞过度增殖、胚胎发育停滞以及内质网应激加剧。此外，该分子伴侣还参与调节植物激素稳态以及盐旱胁迫响应。然而，与胞质HSP90不同，内质网定位的HSP90.7缺乏典型的共伴侣蛋白识别位点，提示其可能依赖自身特定的结构域实现功能调控。在结构上，HSP90.7除了包含保守的N端结构域（NTD）、中间结构域（MD）和C端二聚化结构域（CTD）外，还具有一段位于N端之前的pre-N区域以及C末端的延伸区（CTE）。这些区域在哺乳动物GRP94中已被证明参与调节ATP酶活性和二聚体稳定性，但它们在植物同源蛋白中的功能尚未得到系统研究。

为此，来自多伦多大学的研究团队以拟南芥HSP90.7为对象，综合运用计算模拟、生物化学与遗传学方法，深入探索pre-N与CTE区域在其分子伴侣功能及植物抗逆性中的作用。该项研究近期发表于《Journal of Biological Chemistry》，为认识植物内质网蛋白质量控制机制提供了新的见解。

本研究采用了多种关键技术方法：通过AlphaFold3进行蛋白结构预测与内在无序区分析；利用分子动力学模拟（GROMACS软件，CHARMM27力场）分析蛋白构象动态变化；采用体外表达与纯化技术获得HSP90.7及其突变体蛋白；应用ATP酶活性检测（NADH耦联法）和柠檬酸 synthase（CS）聚集抑制实验评估其生化功能；构建转基因拟南芥株系（在HSP90.7敲除背景下回补pre-N或CTE缺失突变体），观察其在正常与胁迫条件下的表型；通过分子筛层析（SEC）和免疫印迹分析蛋白在植物体内的复合体形成情况。

研究结果如下：

一、ER-localized Arabidopsis HSP90.7 contains a conserved pre-N region

通过AlphaFold3预测发现，拟南芥HSP90.7蛋白二聚体结构中，pre-N与CTE区域表现出较低有序性，属于内在无序区域。序列比对显示，pre-N在植物与哺乳动物间具有约40%的序列一致性，而CTE则存在较大变异。植物HSP90.7的CTE中虽保留酸性特征，但其类“strap”区域（在GRP94中为EEEPEEEPEE）在植物中序列有所不同，提示其功能可能存在物种特异性。

二、Pre-N and CTE introduce structural flexibility

作者构建了三种HSP90.7突变体：缺失pre-N（ΔpN）、缺失C端45个氨基酸（ΔC45）以及双缺失突变体（ΔpNΔC45）。分子筛结果显示，所有突变体仍以二聚体形式存在，说明pre-N与CTE并非二聚化所必需。分子动力学模拟表明，pre-N缺失降低了MD与CTD的结构波动性，而CTE缺失则增加MD的灵活性，说明这两个末端区域以不同方式调节HSP90.7构象动态。

三、Both pre-N and CTE regions regulate HSP90.7 chaperone activity

ATP酶活性实验显示，ΔpN与ΔpNΔC45突变体的ATP水解活性显著提高，k_cat值提高1.6–2.0倍，K_M值降低2–3倍，表明pre-N区域抑制ATP酶活性。而在holdase功能方面，ΔC45突变体抑制CS热聚集的能力大幅减弱，说明CTE区域对分子伴侣的底物结合功能具有重要贡献。有趣的是，双缺失突变体却恢复了部分holdase活性，提示pre-N与CTE之间可能存在功能上的相互制约。

四、Pre-N and CTE regions are dispensable under normal plant growth conditions

在正常生长条件下，表达各型突变体的转基因植株与野生型在萌发、幼苗建成、根系发育以及生殖生长方面均无显著差异，表明pre-N与CTE对HSP90.7的基础功能并非必需。

五、Pre-N and CTE regions are critical for HSP90.7 function under ER stress conditions

在衣霉素（tunicamycin）或钙螯合剂EGTA诱导的内质网应激条件下，pre-N或CTE缺失突变株均表现出明显的叶片白化与生长抑制，说明这两个区域是HSP90.7在应激条件下发挥功能所必需的。分子筛与免疫印迹分析显示，ΔC45突变体在植物体内形成的蛋白复合体分子量较小，提示其与客户蛋白的结合能力受损。

在讨论部分，作者强调pre-N与CTE区域作为HSP90.7的内在调控模块，虽不参与维持其基本结构与二聚化，但在应对内质网应激时发挥关键作用。pre-N可能通过抑制ATP酶活性延缓构象循环，确保客户蛋白有足够时间完成折叠；而CTE则可能通过稳定闭合构象增强底物结合。这一调控机制在一定程度上弥补了内质网HSP90缺乏胞质型共伴侣网络的不足。该研究不仅深化了对植物HSP90.7功能机制的理解，也为利用分子伴侣工程改良作物抗逆性提供了理论依据。