Torula dematia NBRC 6213将花生四烯酸转化为新型生物活性脂质14,15,19-三羟基二十碳三烯酸的机理及优化研究

本研究发现Torula dematia NBRC 6213菌株能将花生四烯酸（ARA）转化为新型生物活性物质14,15,19-三羟基二十碳三烯酸，通过LC-MS/GC-MS/NMR等多维技术解析其结构，并优化转化条件（pH 7.0、28°C、PDB培养基）。该转化过程涉及羟基化、环氧化和水解等多步酶促反应，为微生物合成高值氧化脂质提供了新策略。

　　

Highlight

化学品

花生四烯酸（ARA）购自Sigma–Aldrich公司（美国密苏里州）。所有其他化学品均为分析纯级别并可商业获取。

微生物培养与洗涤细胞制备

使用洗涤后的Torula dematia NBRC 6213（日本千叶NITE生物资源中心保藏菌株）细胞作为脂肪酸转化催化剂。该菌株于添加0.40%马铃薯淀粉和2.0%葡萄糖的PDB培养基（pH 5.1）中培养，接种于含500 mL培养基的2000 mL锥形瓶后，在28°C、200 rpm条件下振荡培养48小时。细胞通过离心收获，用0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤两次，最终重悬于相同缓冲液中。

ARA转化实验

转化反应体系包含20 mg（湿重）洗涤细胞、0.5 mM ARA和2%乙醇，于0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中28°C反应12小时。反应通过添加0.5 M HCl终止，产物用乙醚萃取并经氮吹浓缩。对照实验采用沸水灭活细胞。

脂质提取与分析

转化产物通过高效液相色谱（HPLC）配备紫外检测器（210 nm）进行分析，使用Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 × 250 mm），以乙腈/水/乙酸（70:30:0.1, v/v/v）为流动相，流速1.0 mL/min。液相色谱-质谱联用（LC-MS）采用电喷雾离子源负离子模式检测。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析需先将样品衍生化为三甲基硅醚化合物。核磁共振（NMR）使用氘代甲醇溶剂进行一维和二维谱图采集。

结构解析

UK1的LC-MS谱显示分子离子峰为m/z 353（[M?H]^?），表明其烃链含有三个羟基和三个双键（图2A）。GC-MS谱图中TMS衍生物的特征碎片峰m/z 117、261、323和363进一步验证了羟基位置。通过¹H-NMR、¹³C-NMR、COSY、HSQC和HMBC谱图综合分析，最终确定UK1为14,15,19-三羟基二十碳-5,8,11-三烯酸。

转化路径推测

检测到分子量320、336和338的中间体表明，ARA通过羟基化、环氧化和环氧基水解的级联反应生成目标产物。该菌株对其他不饱和脂肪酸也表现出类似氧化转化能力。

讨论

羟基脂肪酸最初仅在植物体系中有少量发现，其黏度和反应特性区别于普通脂肪酸。近年来多种微生物被证实可将不饱和脂肪酸转化为羟基脂肪酸，例如Clavibacter sp. ALA2能将ARA转化为14,15,19-三羟基二十碳三烯酸（13）。本研究首次报道Torula dematia NBRC 6213具有类似转化功能，且最佳转化条件（PDB培养基、pH 7.0、28°C）与Clavibacter sp.显著不同。中间体分析表明该转化可能通过14-羟基化、15,19-环氧化及水解步骤完成，为微生物合成多羟基脂肪酸提供了新途径。