基于鲨鱼-人嵌合不对称Fc设计的双特异性抗体开发及其纯化优势与应用潜力

本刊推荐：本研究创新性地采用鲨鱼来源的免疫球蛋白新抗原受体（IgNAR）C2结构域替代人IgG Fc的CH2结构域，构建了具有不对称结构的嵌合双特异性抗体（BsAb）。该设计通过引入物种间结构差异，成功解决了传统BsAb生产中同源二聚体副产物难以纯化的痛点，并利用pH梯度洗脱实现了目标产物与可溶性聚集体的高效分离。此外，通过引入N-糖基化修饰进一步优化了副产物问题，为BsAb的开发提供了新范式。

　　

Highlight

Antibody design and construction

本研究设计了嵌合不对称Fc区域以增强双特异性抗体（BsAbs）的生产与纯化。抗体设计与构建如图1所示。通常IgG抗体的抗原结合区为Fab（由轻链和部分重链（V_H-C_H1区）组成）。为简化设计并避免轻链错配，本研究中的BsAbs采用两个VNAR单域纳米抗体替代传统Fab区域，直接融合至重链的Fc区域两端。其中一条重链保留完整的人IgG1 Fc序列（包含C_H2与C_H3结构域），而另一条重链的C_H2结构域则被鲨鱼免疫球蛋白新抗原受体（IgNAR）的C2结构域所替代。这种设计形成了物种来源不对称的Fc异二聚体：一侧为人源C_H2-C_H3，另一侧为鲨鱼源C2-人C_H3。该策略利用人与鲨鱼恒定区之间的天然序列差异，以及IgNAR C2结构域与人FcRn结合能力较弱的特点，旨在赋予BsAb在蛋白A亲和色谱中独特的洗脱行为，从而更易分离纯化目标BsAb，并减少由错误配对引起的同源二聚体副产物的污染。

Preparation of expression plasmids and BsAb expression in CHO cells

编码BsAb的质粒DNA通过GenPlus服务（Genscript, 中国南京）制备。合成DNA被亚克隆至带有CAG启动子和EB病毒oriP复制起始序列的内部表达载体中。所得质粒转染至稳定表达EBNA1的CHO-K1细胞。该基于oriP-EBNA1的附加体表达系统可通过质粒DNA在哺乳动物细胞中的复制实现重组蛋白的高产。转染后，细胞在37°C、5% CO₂条件下于CD CHO培养基（Thermo Fisher Scientific）中培养7天，随后收集上清液并通过0.22 μm过滤器过滤。表达的抗体使用蛋白A琼脂糖树脂（Cytiva）通过亲和色谱纯化，并用pH 3.0的甘氨酸-HCl缓冲液洗脱。立即用Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中和洗脱液，并在PBS中进行透析。