利用pelB信号肽实现假单胞菌来源II型L-天冬酰胺酶的高效分泌表达及工艺优化

本文系统研究了来自Pseudomonas sp. PCH199的II型L-天冬酰胺酶（L-ASNase）在E. coli中的分泌表达机制。通过pelB信号肽引导重组酶定向转运至周质空间，结合表面活性剂优化使胞外酶产量提升133%（0.77 mg/mL），并建立单步层析纯化工艺，获得比活性达60.0 U/mg的高纯度酶制剂，为白血病治疗酶制剂的高效制备提供了创新性解决方案。

　　

Highlight

材料

T4 DNA连接酶、限制性内切酶和DNA ladder（1.0 kb）购自赛默飞世尔科技（美国马萨诸塞州）。Taq DNA聚合酶购自新英格兰生物实验室（英国赫钦）。用于蛋白质纯化的Q-琼脂糖购自通用电气医疗（美国芝加哥）。蛋白质分子标记（Precision Plus Protein?）购自伯乐公司（美国加州）。pET-26b(+)载体购自诺瓦苷（德国默克密理博）。本实验所需的其他化学试剂和培养基组分均采购自希格玛奥德里奇（美国密苏里州）。

基因克隆

Pg-asn II基因（1.0 kb）成功从Pseudomonas sp. PCH199的重组克隆（pET-47b(+)-Pg-ASNase II）中扩增获得（图S1）。插入的Pg-asn II序列经桑格测序验证，确认获得完整开放阅读框。BLAST分析显示该序列与Pseudomonas sp. PCH199的II型L-ASNase（Genbank ID: OM621889.1）具有100%相似性，与Pseudomonas frederiksbergensis菌株AS1（Genbank ID: CP018319.1）具有91.1%相似性。

结论

本研究成功建立了Pseudomonas sp. PCH199来源II型L-天冬酰胺酶的胞外表达系统。该体系通过简化下游处理流程显著提升酶产量，Pg-asn II基因在pET-26b(+)载体中克隆后于E. coli BL21(DE3)成功表达。吐温80的添加使胞外酶产量显著提升，有效降低下游处理成本。该分泌表达技术的突破为治疗性酶制剂的大规模生产提供了新的技术路径。

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