15N最优控制脉冲：一种在高磁场下增强异核检测NMR实验效率的方法

《Journal of Magnetic Resonance》：15N optimal control pulses: an efficient approach to enhance heteronuclear-detected NMR experiments at high magnetic fields

碳-13检测的核磁共振（NMR）实验在高场（1.2 GHz）下通过最优控制（OC）设计的15N脉冲显著提升了宽频带激励和信号灵敏度，尤其对远离载波频率的信号增强效果显著。实验验证了OC脉冲在折叠蛋白（如泛素）和无序蛋白（如α-突触核蛋白）中的高效性，即使在高盐缓冲条件下仍保持优势。

　　在当前的核磁共振（NMR）技术中，碳-13检测实验已经成为研究生物分子系统的重要工具，尤其在解析结构和动态特性方面展现出独特的优势。随着高场NMR谱仪的发展，尤其是在1.2 GHz的磁场条件下，研究人员能够获得前所未有的分辨率，这对于解析具有复杂NMR谱图的样品尤为重要。然而，高场环境下的操作也带来了新的挑战，例如需要在广泛的频率范围内实现高效的自旋操控，同时还要遵守现代探头的功率限制。为了解决这些问题，最优控制（Optimal Control, OC）理论提供了一种强有力的框架，能够设计出高效且符合实验条件的射频（Radio-Frequency, RF）脉冲，从而实现所需的自旋操控。

本研究聚焦于在1.2 GHz磁场条件下，通过使用OC设计的氮-15（¹⁵N）脉冲来优化碳-13（¹³C）检测实验的性能。具体来说，我们展示了这些脉冲如何提高激发带宽和信号灵敏度。为了验证这一方法的有效性，我们选取了两种不同的样品：一种是结构较为明确的小型折叠蛋白，另一种是需要在高盐缓冲液中稳定存在的天然无序蛋白（Intrinsically Disordered Protein, IDP）。研究结果表明，¹⁵N OC脉冲在多种样品类型和实验条件下都表现出显著的优势，证实了其在高场NMR实验中作为稳健解决方案的潜力。

在NMR实验中，¹³C检测因其能够提供丰富的结构和动态信息而被广泛采用。这种信息来源于碳-13的化学位移值、弛豫参数、溶剂交换速率，甚至可以用于体内NMR研究。此外，使用非交换性核如羰基碳-13（¹³C′）核可以实现更广泛的样品条件适应性，这对于那些在溶液中具有快速质子交换的蛋白质（如IDP）尤为重要。在某些情况下，¹³C′-¹⁵N交叉峰表现出比¹H^N-¹⁵N更大的化学位移分散，这有助于提升谱图的分辨率。

然而，1.2 GHz的高场条件下，由于磁场的增强，磁化转移路径（如1/2J_CN）变得较长，通常在33毫秒左右。这种较长的路径会导致在脉冲序列期间更多的弛豫损失，从而降低信号强度。此外，¹³C的旋进比（gyromagnetic ratio）低于¹H，这进一步降低了¹³C检测实验的灵敏度。尽管如此，高场磁体和探头设计的进步正在逐步缓解这些限制，从而提高整体实验的灵敏度。特别是，1.2 GHz磁场下的商业NMR仪器的出现，使得获得超高分辨率的谱图成为可能。

为了应对高场条件下广泛的频率范围需求，OC理论提供了一种创新的方法，即通过设计自旋操控脉冲来实现更宽的激发带宽，同时保持较低的峰值功率。这不仅有助于减少样品加热和硬件限制的影响，还能够提高脉冲的鲁棒性，使其在RF场不均匀性等方面表现更优。在本研究中，我们特别关注了¹⁵N OC脉冲的应用，尤其是在需要覆盖更宽频率范围的实验中，如多维三共振实验。这些脉冲能够有效提升信号强度，尤其是在远离载波频率的区域。

在实验方法部分，我们使用了Bruker Avance NEO NMR谱仪，其工作频率为1200.63 MHz（¹H）、301.90 MHz（¹³C）和121.66 MHz（¹⁵N）。为了实现¹⁵N OC脉冲的应用，我们调整了标准脉冲序列，并使用了两种不同的探头：一种是优化用于¹³C直接检测的CP-TXO探头，另一种是用于三共振检测的CP-TCI探头。我们测试了多种¹⁵N脉冲，包括硬脉冲、Bip脉冲以及OC脉冲。通过比较这些脉冲在不同实验中的表现，我们发现OC脉冲在信号强度和灵敏度方面具有明显优势。

在实验结果部分，我们展示了OC脉冲在多个实验中的应用效果。例如，在简单的¹⁵N一维实验中，使用OC脉冲比使用标准硬脉冲能够获得更高的信号-噪声比（SNR），尤其是在远离载波频率的区域。这一结果在图1中得到了验证，其中使用OC脉冲的谱图在信号强度方面明显优于标准硬脉冲。在2D CON实验中，我们进一步比较了OC脉冲与Bip脉冲和硬脉冲的效果。结果显示，OC脉冲在激发带宽和信号灵敏度方面表现更优，尤其是在远离载波频率的区域，其信号强度显著提升。此外，在3D CBCACON实验中，OC脉冲的应用也带来了更清晰的信号和更高的灵敏度，使得原本难以观测的信号得以显现。

对于天然无序蛋白（IDP）的研究，¹H^α检测是一种常见的替代方法。在本研究中，我们使用了OC脉冲在3D HCAN实验中进行测试，发现其在信号强度和灵敏度方面均优于Bip脉冲和硬脉冲。特别是，在高盐缓冲液中，由于高离子强度对探头质量因子（Q-factor）的影响，常规脉冲需要更长的RF脉冲来覆盖所需的频率范围，而OC脉冲则能够在保持较低峰值功率的同时实现更宽的激发带宽，从而提升实验的整体性能。

总体而言，本研究通过引入OC设计的¹⁵N脉冲，显著提升了¹³C检测实验的性能。这些脉冲不仅能够提高信号灵敏度，还能够增强激发带宽，尤其是在远离载波频率的区域。此外，OC脉冲在处理高盐缓冲液中的样品时也表现出良好的适应性，这对于IDP研究尤为重要。未来的研究将进一步探索OC脉冲在针对特定侧链进行选择性实验中的应用，以及将其扩展至其他核素（如¹⁹F）的可能性，以适应更广泛的研究需求。