Orm2通过调控LCB-Ypk1-Orm1信号通路介导氮诱导的鞘脂合成及内吞作用

本研究针对酵母Orm家族蛋白功能冗余的传统认知，通过脂质组学分析和分子生物学技术，揭示了Orm2通过调控长链碱基（LCB）水平介导Ypk1依赖性Orm1磷酸化，进而促进氮充足条件下鞘脂合成和内吞作用的新机制。研究发现Orm2缺失导致LCB积累并抑制CerS活性，而氮补充通过Torc1依赖的Orm2去磷酸化激活LCB-Ypk1-Orm1信号轴，该通路对氨基酸透酶Gap1的内吞至关重要，为鞘脂代谢与营养感知的交叉调控提供了新范式。

　　

在真核细胞中，鞘脂（sphingolipids, SPLs）不仅是细胞膜的重要结构组分，更是调控细胞生长、应激反应和信号转导的关键分子。鞘脂生物合成始于内质网中的丝氨酸棕榈酰转移酶（serine palmitoyltransferase, SPT）催化的缩合反应，生成鞘脂前体长链碱基（long-chain bases, LCBs），随后经一系列修饰形成复杂的鞘脂。这个过程受到精密调控，其中Orm（Orosomucoid）家族蛋白作为SPT的负调控因子，通过结合SPT催化亚基抑制其活性。在酿酒酵母中，存在两个Orm同源蛋白——Orm1和Orm2。长期以来，科学界普遍认为它们功能冗余，主要协同维持鞘脂稳态。然而，越来越多的证据表明，这两个蛋白可能具有独特功能：Orm2缺失会导致对油酸和衣霉素的超敏反应，而Orm1缺失则不会；只有Orm2会受到内吞和高尔基相关降解途径（EGAD）的调控；在人类中，ORMDL3（Orm同源蛋白）与哮喘、克罗恩病等多种疾病相关，而ORMDL1和ORMDL2则未显示类似强关联。这些现象暗示，Orm蛋白可能具有超越简单反馈调节的、更为精细的分工。

传统模型认为，Orm蛋白通过抑制SPT活性来控制LCB合成，并假定LCB会顺利通过下游途径转化为复杂鞘脂。因此，当Orm2功能异常时，Orm1的磷酸化状态会发生补偿性变化，以平衡鞘脂水平。但这一模型是否完整？Orm1和Orm2究竟是如何协作的？它们是否参与了特定的生理过程？为了回答这些问题，Jihui Ren和Yusuf A. Hannun团队开展了深入研究，其成果发表在《Journal of Lipid Research》上。

研究人员综合运用了靶向脂质组学（HPLC-ESI-MS/MS）、同位素标记（D₂-Ser示踪）、蛋白质免疫印迹（Phos-tag SDS-PAGE）、基因敲除株构建（CRISPR-Cas9系统）以及荧光显微镜成像等技术手段，对野生型、orm1Δ和orm2Δ酵母菌株进行了系统分析。所有实验均使用酿酒酵母BY4741背景菌株，在合成确定培养基（SD）以及氮匮乏（–N）和氮充足（+N）条件下进行培养。

研究结果首先揭示了Orm1和Orm2对鞘脂代谢的截然不同的影响。

Distinct effects of orm1Δ and orm2Δ on SPL metabolism.

通过脂质组学分析，作者发现缺失Orm1（orm1Δ）会导致复杂鞘脂水平显著升高，而LCBs水平变化不大，表明LCB能有效转化为下游鞘脂。相反，缺失Orm2（orm2Δ）则引起LCBs及其磷酸化产物（如PHS-1-P）的剧烈积累，但复杂鞘脂水平并未增加。利用D₂-Ser标记实验动态追踪鞘脂合成 flux，作者进一步证实orm2Δ细胞中存在CerS（ceramide synthase）活性缺陷，导致LCB向神经酰胺的转化受阻。这些结果表明，Orm1和Orm2在鞘脂代谢中扮演不同角色：Orm1直接调控复杂鞘脂水平，而Orm2主要影响LCBs的生成和转化。

Orm2 controls Ypk1-dependent Orm1 phosphorylation through regulating LCB production

之前的研究观察到，Orm1的磷酸化在orm2Δ细胞中降低，并被归结为对复杂鞘脂水平变化的补偿。本研究挑战了这一观点。作者发现，orm2Δ细胞中Orm1磷酸化的降低是由于积累的LCBs（特别是PHS）抑制了Ypk1激酶的活性。通过药理学方法（SPT抑制剂myriocin）或遗传学方法（敲除SPT正调控因子TSC3或LCB磷酸酶LCB3）降低LCB水平，均可恢复orm2Δ细胞中的Orm1磷酸化。相反，外源性添加PHS能在数分钟内迅速且可逆地降低Orm1磷酸化。这些实验证明，是LCBs（而非下游复杂鞘脂）通过调控Ypk1来影响Orm1的磷酸化状态，从而定义了Orm2-LCB-Ypk1-Orm1这一新的调控模块。

Nitrogen induces increased SPL synthesis

接下来，作者探讨了这一新模块的生理意义。他们选择研究酵母对氮可利用性的响应，这是一个已知会调控内膜运输（如Gap1内吞）的关键生理过程。研究发现，在氮充足条件下，酵母细胞中的各类鞘脂（LCBs、LCB-1-P、神经酰胺）水平显著升高。D₂-Ser标记实验证实，氮充足增强了SPT的活性，促进了鞘脂的从头合成。

Orm2 is required for nitrogen-induced SPL synthesis by regulating Ypk1-depenedent Orm1 phosphorylation

机制探索表明，氮补充引发了Orm1和Orm2截然相反的磷酸化响应：Orm2迅速去磷酸化（激活），而Orm1则发生磷酸化（失活）。这一过程依赖于Ypk1的激活。在orm2Δ细胞中，氮补充无法引起Ypk1激活和Orm1磷酸化。Torc1抑制剂雷帕霉素（rapamycin）能阻断氮诱导的Orm2去磷酸化和Orm1磷酸化，表明该过程依赖于Torc1信号。更重要的是，D₂-Ser标记显示，orm2Δ细胞虽然基础鞘脂水平较高，但无法在氮充足条件下实现最大程度的鞘脂合成（尤其是神经酰胺的生成），而orm1Δ细胞则响应正常。这证明Orm2是氮诱导的鞘脂合成所必需的。

Orm1 and Orm2 play distinct roles in nitrogen-induced endocytosis of Gap1

最后，作者研究了鞘脂合成与功能的关系。鞘脂已被证明参与调控内吞作用。本研究聚焦于氮调控的通用氨基酸透酶Gap1的内吞。发现抑制SPT（myriocin处理）或缺失Ypk1会完全阻断氮诱导的Gap1内吞。值得注意的是，无法被磷酸化的orm1^AAA突变体表现出Gap1内吞的延迟，而orm2^AAA突变体内吞正常。这功能差异与两者在鞘脂合成中的角色完美对应：Orm1的失活（磷酸化）直接促进鞘脂合成，从而支持内吞；而Orm2的作用在于启动这一过程。

讨论与结论

本研究彻底改变了我们对酵母Orm蛋白功能的认识。它揭示Orm1和Orm2并非简单冗余，而是构成了一个精巧的级联调控模块：Orm2作为上游调控因子，通过控制LCB的生成来调节Ypk1的活性，进而决定Orm1的磷酸化状态和SPT的活性。这一Orm2-LCB-Ypk1-Orm1模块被证明是连接氮营养感知（Torc1信号）与鞘脂合成及下游内膜运输（如Gap1内吞）的关键桥梁。

其重要意义在于：

1. 1.
   理论模型创新：研究提出了一个超越传统“稳态补偿”模型的“调控模块”新概念，为理解Orm蛋白家族的功能提供了新框架。
2. 2.
   机制深度解析：明确了LCBs作为关键信号分子直接调控Ypk1激酶活性，揭示了鞘脂代谢中间产物的信号功能。
3. 3.
   生理功能连接：将鞘脂代谢与核心的营养感知信号通路（Torc1）和关键的细胞膜运输过程（内吞）直接联系起来，阐明了鞘脂在细胞适应环境变化中的具体作用。
4. 4.
   进化与疾病启示：Orm蛋白功能的特异性分化（如酵母Orm2与人类ORMDL3）暗示了其在进化过程中的功能特化，为研究ORMDL3相关疾病的病理机制（如哮喘、炎症性肠病）提供了新的视角，即可能通过影响特定的鞘脂代谢信号轴而非全局稳态来实现。

总之，这项研究不仅深化了对鞘脂代谢调控的理解，也展示了细胞如何通过复杂的信号网络整合营养状态与膜脂代谢，以协调生长与适应反应。