ISWI染色质重塑酶通过诱导组蛋白动态变化促进核小体DNA转位的机制研究

本刊推荐：为解决染色质重塑过程中组蛋白构象变化的作用机制问题，研究人员通过溶液NMR光谱技术研究了果蝇ISWI重塑酶及其与核小体复合物的构象动态。发现ISWI的NTR区含有高动态DNA结合环，NegC结构域在游离状态下与ATPase lobe 2结合，且ATPase叶瓣和NegC结构域存在显著的μs-ms运动。研究证实去抑制的ISWI构建体可诱导组蛋白八聚体产生最显著的构象变化，影响组蛋白-DNA和组蛋白-组蛋白接触。这些发现深化了对ISWI构象景观的理解，为重塑过程中组蛋白可塑性促进DNA转位提供了有力支持。

　　

在真核细胞中，基因组DNA通过缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体结构，这种染色质基本单元在保护DNA的同时也限制了基因的可及性。染色质重塑酶(chromatin remodelers)作为一类依赖ATP水解的分子机器，能够通过改变核小体间距和位置来调控基因表达。其中ISWI(Imitation SWItch)家族重塑酶在染色质成熟和空间组织中发挥关键作用，它通过将DNA在组蛋白表面进行转位(translocation)来实现核小体滑动，而不破坏核小体结构。尽管近年来通过冷冻电镜(cryo-EM)技术在结构表征方面取得了巨大进展，但组蛋白构象变化在重塑过程中的作用程度仍不明确，同时调控性NTR(N-terminal region)和NegC(negative element at C-terminus)结构域的构象和动态也难以获得。

为了解决这些关键问题，由Vincenzo R. Lobbia、Clara L. van Emmerik、María Cristina Trueba Sánchez、Johanna Ludwigsen、Felix Mueller-Planitz和Hugo van Ingen组成的研究团队利用溶液NMR光谱技术对果蝇ISWI及其与核小体的复合物进行了深入研究。这项工作发表在《Journal of Molecular Biology》上，为理解染色质重塑的分子机制提供了新的见解。

研究人员主要运用了核磁共振光谱技术(NMR spectroscopy)，特别是甲基-TROSY(transverse relaxation optimized spectroscopy)方法，结合分子建模、位点定向突变和生化活性分析等方法。研究使用了果蝇(Drosophila melanogaster)的ISWI蛋白和爪蟾(Xenopus laevis)的组蛋白，通过体外重构制备了核小体样品。

ISWI⁶⁴⁸具有高度动态的NTR环

通过¹⁵N标记的ISWI⁶⁴⁸(包含26-648位氨基酸残基)的NMR研究，发现NTR区包含一个高度动态的DNA结合环，其中AT-hook序列(PKGRP，71-75位残基)暴露于溶剂中可用于DNA结合。NegC结构域除末端几个残基外未检测到信号，支持其采用紧凑的而非扩展的构象。这些发现支持了ISWI抑制状态的混合模型，其中ATPase叶瓣大幅旋转相对彼此，NTR的螺旋元件与叶瓣1和2结合，通过柔性环连接。

游离ISWI⁶⁴⁸中存在普遍的慢运动

利用甲基-TROSY NMR对完全氘代仅异亮氨酸δ1甲基标记的ISWI⁶⁴⁸进行研究，发现39个异亮氨酸中有20个表现出显著的弛豫分散，表明在整个蛋白质中存在构象交换过程。特别是位于NegC与叶瓣2界面处的所有三个异亮氨酸δ1基团都显示出显著的交换贡献，表明该界面的构象动态对于核小体结合后释放NegC抑制可能很重要。

核苷酸和核小体结合引起ISWI⁶⁴⁸构象变化

ADP结合导致7个未 assigned共振以及I181、I183和I283的化学位移和/或峰强度变化，而添加BeFx没有引起进一步显著变化。核小体滴定实验显示，ISWI与核小体结合处于慢交换 regime，表明紧密结合。在2:1 ISWI:核小体比率下，NegC C末端残基的共振出现倍增，表明两个结合的ISWI分子可能具有不同的NegC构象。

NegC中643-648位残基对自抑制非必需

通过缺失突变体ISWI⁶⁴²(26-642位残基)的染色质重塑活性分析发现，其表现出低重塑活性，与ISWI⁶⁴⁸构建体相似，表明NegC抑制机制与CHD1中描述的跨叶瓣锁不同。

ISWI结合诱导H4尾构象变化

使用定制标记方案(氘代背景下的H2B亮氨酸和缬氨酸甲基标记、H3异亮氨酸δ1甲基标记以及H4的¹⁵N标记)的核小体研究表明，ISWI结合导致H4尾信号强度普遍下降约50%，并出现一个新的峰(标记为"X")，其化学位移与预测的V21随机线圈化学位移匹配良好。

ISWI ATP酶结合扰动组蛋白-组蛋白和组蛋白- DNA接触

甲基-TROSY光谱显示，ISWI结合虽然没有引起明显的化学位移变化，但导致了所有组蛋白甲基基团的峰强度下降，且这种下降表现出残基特异性。最显著的影响出现在H3 I62和I74(靠近ISWI结合的SHL 2位置)、H3 I130(H3-H3'界面)和H2B L97(H2B-H4界面)。去抑制的ISWI⁶¹⁷构建体在ADP-BeF_x存在下引起最显著的组蛋白甲基信号强度下降，特别是在H2B-H4界面和靠近DNA的H3残基处。

研究结论表明，游离ISWI是一个高度动态的酶，其自抑制性NTR和NegC包含高度柔性元件，而不是简单的刚性"锁"来抑制ATP酶结构域。ISWI与核小体的结合诱导了组蛋白八聚体内的大规模构象变化，涉及H2A-H2B、H3-H4、它们的界面以及组蛋白-DNA界面，且效应的精确模式和强度取决于核苷酸状态和ATP酶构象。

讨论部分强调，这项研究提供的NMR数据强烈支持组蛋白八聚体构象变化在ISWI重塑中的作用。去抑制的ISWI构建体(ISWI⁶¹⁷)在ATP模拟物ADP-BeF_x存在下引起最显著的组蛋白甲基信号线宽增加，特别是在H2B-H4界面和靠近DNA的H3残基处，这与重塑酶在此条件下将DNA推向dyad的预期作用相关。研究结果与之前的冷冻电镜研究中观察到的细微构象变化形成对比，突显了NMR在检测低占据率构象状态动态互换方面的独特敏感性。

总之，这项工作通过NMR光谱揭示了ISWI染色质重塑酶和核小体-ISWI复合物的构象动态特征，发现了游离ISWI是一个高度动态的分子机器，其自抑制性调控结构域包含柔性元件而非刚性锁。研究证实ISWI与核小体的结合诱导了组蛋白八聚体内的大规模构象变化，这些变化在去抑制的ATP酶构象和ATP结合状态下最为显著。这些发现深化了对染色质重塑分子机制的理解，强调了组蛋白可塑性在促进DNA转位过程中的重要作用，为表观遗传调控提供了新的理论基础。