靶向酶解茶渣蛋白-多糖复合物：一种提升其乳化性能及界面稳定性的可持续策略

本研究针对茶渣蛋白提取物（TRPE）因与果胶、纤维素等多糖强烈相互作用而乳化性能受限的问题，开发了一种靶向酶解多糖的策略。研究人员系统比较了碳水化合物酶、蛋白酶和转谷氨酰胺酶（TG）的处理效果，发现选定的碳水化合物酶（Viscozyme? L、果胶酶、纤维素酶）能有效破坏蛋白-多糖复合物，使乳化活性指数（EAI）较未处理对照组提升2.4倍（P < 0.05），并显著优于蛋白酶和TG。机理分析表明，多糖降解减少了离子键和氢键（>90%），暴露了疏水基团（游离巯基增加220%），并促进了β-折叠的形成（高达56%），从而促进了致密界面膜的形成。这项研究为将食品加工副产物转化为清洁标签的植物基乳化剂提供了一条可持续且结构导向的途径，有助于农业工业副产物的功能化高值利用。

　　

在追求可持续和健康食品配方的浪潮中，植物蛋白乳化剂作为可靠且环保的替代品受到了广泛关注。茶渣，作为茶叶加工的副产物，含有约占其干重20%–30%的蛋白质，其氨基酸组成与大豆蛋白相似，是一种极具潜力的资源。目前，茶渣蛋白主要通过碱提法获得，提取率可达约95%。然而，这个过程可能会引起蛋白质的结构改变或降解，导致其乳化等功能性质变差或丧失，从而限制了它们的应用。目前，蛋白酶处理是增强植物蛋白乳化特性的主要策略，它通过选择性水解肽键，暴露疏水残基，并改变蛋白质的结构和功能来发挥作用。然而，茶渣中丰富的非蛋白质成分，尤其是果胶和纤维素，在提取过程中会导致蛋白质-多糖聚集，这限制了蛋白酶处理增强乳化的能力。

与传统的植物蛋白不同，茶渣蛋白嵌入在一个富含多糖的基质中，这些多糖通过离子键、氢键和非共价力与蛋白质相互作用，包裹疏水基团，改变分子间作用力和二级结构。这些相互作用限制了蛋白质在油水界面的灵活性和构象重排，从而削弱了乳化效率。此外，果胶和纤维素的高亲水性和差表面活性进一步损害了乳液的稳定性。这种行为与在大豆和豌豆蛋白系统中常见的多糖添加的积极效果形成鲜明。鉴于这些独特的障碍，碳水化合物酶（如果胶酶、Viscozyme? L）被用于靶向降解多糖，破坏蛋白质-多糖聚集体，以暴露功能性蛋白质结构域，同时保留多肽完整性。通过调节分子间相互作用和二级结构，这种策略可以在不进行广泛蛋白水解的情况下增强乳化作用，为茶渣的价值提升和推进对植物基乳化剂结构-功能关系的理解提供了一条可持续的途径。

为了阐明经过靶向酶修饰的茶渣蛋白提取物（TRPE）的结构-功能关系，从而确定增强其乳化性能以用于食品配方的策略，研究人员开展了一项系统性的研究。他们首先通过碱提酸沉法获得了TRPE，然后使用各种酶（包括蛋白酶（碱性蛋白酶和胃蛋白酶）、转谷氨酰胺酶（TG）以及碳水化合物酶（果胶酶、Viscozyme? L、阿拉伯聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶和纤维素酶）对其进行水解。考察了水解前后TRPE的乳化特性。此外，还检测了蛋白质游离巯基、分子间作用力和二级结构的变化，以确定影响TRPE乳化特性的关键成分。对酶处理后的TRPE进行了透析（3 kDa），并评估了透析前后其组成、乳化特性、分子间作用力和蛋白质二级结构的变化。最后，进行了相关性分析，以探索蛋白质游离巯基、分子间作用力、二级结构与乳化特性之间的关系。

本研究主要应用了以下关键技术方法：使用碱性提取和酸沉淀制备茶渣蛋白提取物（TRPE）；采用多种酶（包括蛋白酶、转谷氨酰胺酶和碳水化合物酶）在特定pH和温度条件下对TRPE进行水解处理；通过测定乳化活性指数（EAI）、乳化稳定性指数（ESI）和析乳指数（CI）来评估乳化性能；利用动态光散射技术测量乳液滴粒径（D(4,3)）；采用Ellman法定量游离巯基含量；通过不同系列的盐和尿素溶液区分并定量离子键、氢键和疏水相互作用等分子间作用力；运用圆二色谱（CD）分析蛋白质的二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲）组成。茶渣样本由福建大闽食品有限公司（中国漳州）提供。

3.1. 酶处理对TRPE乳化特性的影响

酶处理显著增强了TRPE的乳化性能，其中碳水化合物酶的效果优于蛋白酶。Viscozyme? L水解10小时后达到了最高的EAI，为69.1 m²·g^-1（是对照组的2.4倍），而果胶酶在0.5小时内就达到了62.5 m²·g^-1（2.0倍对照）。纤维素酶在初期有效（0.5小时时62.6 m²·g^-1），但 prolonged 水解反而降低了EAI。相比之下，蛋白酶如胃蛋白酶需要较长的处理时间（10小时）才能达到相当的EAI（62.5 m²·g^-1），而碱性蛋白酶的效果则随着时间下降。稳定性分析进一步强调了碳水化合物酶的优势：Viscozyme? L在15天后仍保持86%的CI，木聚糖酶/半纤维素酶在10小时时CI达到100%，而纤维素酶保持中等稳定性（84% CI）。TRPE的乳化主要受到果胶和纤维素的阻碍，它们包裹了疏水蛋白结构域。对这些多糖（尤其是通过Viscozyme? L或果胶酶降解果胶）的靶向降解释放了功能性蛋白区域，实现了快速稳定的乳化。

3.2. 酶处理对TRPE蛋白质结构的影响

3.2.1. 游离巯基含量

酶处理显著调节了TRPE的游离巯基（SH）含量，碳水化合物酶在暴露疏水区域方面表现出优于蛋白酶的效果。Viscozyme? L和纤维素酶在10小时后分别将SH含量最大化至15.3和14.2 μmol·g^-1。碱性蛋白酶和阿拉伯聚糖酶在30分钟内实现了SH的快速增加（9.5–9.8 μmol·g^-1），但 prolonged 蛋白酶水解落后于碳水化合物酶。值得注意的是，TG处理降低了SH含量，突出了其通过交联促进蛋白质聚集的作用。碳水化合物酶——尤其是Viscozyme? L——通过选择性降解多糖基质（果胶、纤维素）来增强TRPE疏水性，从而暴露功能性蛋白质结构域。这种结构释放对于改善乳化至关重要，同时受控的水解避免了与蛋白酶相关的过度降解风险。

3.2.2. 非共价作用力含量

酶处理差异性地调节了TRPE中的分子间作用力，碳水化合物酶（如Viscozyme? L和果胶酶）在破坏离子键和氢键方面表现出优于蛋白酶的效果。水解10小时后，Viscozyme? L将离子键和氢键对可溶蛋白浓度的贡献分别从68.2降至2.6 mg·L^-1（减少96%）和从68.5降至1.2 mg·L^-1（减少98%）。相比之下，蛋白酶的效果较弱：胃蛋白酶将氢键的贡献降低至约5.0 mg·L^-1（减少约74%）。这种差异源于不同的作用机制：碳水化合物酶降解多糖（如果胶和纤维素），直接拆散了稳定多糖-蛋白质基质的离子/氢键，而蛋白酶水解肽链，主要破坏离子相互作用，对氢键影响最小。TG处理通过交联增加了离子键和氢键的贡献，但降低了疏水相互作用的贡献，反映了其促进聚集的作用。疏水相互作用进一步被半纤维素酶和木聚糖酶降低，它们打破了多酚-半纤维素交联。这些结果突显了果胶和纤维素是TRPE乳化的主要障碍，碳水化合物酶驱动的降解为削弱分子间作用力和增强功能提供了一种靶向策略。

3.2.3. 蛋白质二级结构

酶处理显著重塑了TRPE的二级结构，碳水化合物酶驱动了显著的向β-折叠形成的转变，这对乳化至关重要。未经处理的TRPE表现出平衡的β-折叠和无规卷曲比例（各37%），而α-螺旋含量很低（11%）。Viscozyme? L在10小时后将β-折叠提高至43%（对照为37%），而果胶酶在10小时时达到53%的β-折叠峰值，这可能是由于多糖降解暴露了有利于β-折叠堆叠的疏水结构域。阿拉伯聚糖酶和纤维素酶在0.5小时内迅速提高了β-折叠（7.1–9.0%），强调了它们对多糖-蛋白质相互作用的立即破坏。相比之下，蛋白酶表现出时间依赖的不稳定性：胃蛋白酶在2小时时将β-折叠最大化至56.1%，但使α-螺旋含量崩溃至0.3%，反映了激进的肽水解破坏了天然折叠。TG通过交联独特地稳定了α-螺旋（14%）和β-转角（23），增强了分子内键但限制了界面吸附所需的分子灵活性。这些结构变化与分子间作用力的变化一致。碳水化合物酶驱动的多糖降解削弱了离子/氢键，使得富含β-折叠的构型成为可能，而蛋白酶诱导的肽 fragmentation 破坏了α-螺旋而没有维持β-折叠稳定性。在碳水化合物酶处理的TRPE中β-折叠和无规卷曲的主导地位与增强的乳化相关，将碳水化合物酶定位为功能修饰的最佳选择。

3.2.4. 酶处理后蛋白质结构与乳化特性的相关性分析

TRPE的酶修饰揭示了一个多方面的机制，通过该机制，蛋白质结构重组和多糖降解协同增强了乳化特性。一个关键发现是分子间作用力（离子键和氢键）与EAI呈显著负相关（分别为r= -0.482和-0.385；p < 0.05），表明削弱蛋白质-蛋白质相互作用改善了溶解性和界面吸附。β-折叠结构与CI表现出矛盾的正相关，挑战了它们作为刚性、抗吸附构象的传统作用。分子动力学模拟表明，TRPE中的β-片层在油水界面采用平行链构型，形成机械坚固 yet 适应性强的薄膜，既能抵抗聚结，又能适应剪切应力。这种结构双重性解释了为什么胃蛋白酶处理的TRPE（56% β-折叠含量）同时实现了高CI（>90%）和快速吸附动力学（最小滴粒径）。相比之下，α-螺旋结构显示出与EAI的负趋势，可能是由于其降低的构象灵活性。同时，β-转角和无规卷曲与EAI没有显著相关性，可能在特定条件下有助于构象灵活性。碳水化合物酶介导的多糖降解引入了一条不同于蛋白水解作用的新的稳定途径。果胶和纤维素的酶切产生了低聚糖，它们通过形成空间障碍和增强连续相粘度来补偿减少的静电排斥。例如，β-葡聚糖酶衍生的低聚糖保持了长期稳定性（15天ESI >70%），尽管滴粒径增加，而纤维素酶产生的片段形成了混合界面层，抵抗絮凝。这些结果与传统的多糖功能性形成对比，后者中完整的聚合物主要通过静电排斥稳定乳液。酶特异性决定了结构和功能结果。Viscozyme? L（一种靶向果胶和纤维素的碳水化合物酶）独特地破坏了多糖-蛋白质复合物，释放了疏水结构域并减小了滴粒径（D(4,3) = 76 nm）。相比之下，胃蛋白酶的酸性水解主要暴露疏水残基并减少β-转角含量，增强了短期吸附动力学但对长期稳定性影响较小。TG例证了一种替代策略，通过交联（D(4,3) = 83 nm）加强界面膜，同时放大静电排斥（Zeta电位 = -73 mV），这是一种机械和电荷稳定的协同作用。β-折叠灵活性、多糖片段保留和减少的分子间作用力之间的相互作用支撑了TRPE增强的乳化。为了分离低分子量组分（如低聚糖）的作用，随后的透析实验选择性地去除了这些片段，直接将它们的存在与构象适应性（如α-螺旋抑制）和乳化功效联系起来。

3.3. 透析对酶处理TRPE基本成分的影响

酶处理和透析后TRPE的基本组成分析揭示了碳水化合物酶和蛋白酶调节其结构和功能特性的不同机制。未经处理的TRPE主要由蛋白质（476 g·kg^-1）、碳水化合物（155 g·kg^-1）和多酚（55 g·kg^-1）组成。单独透析使蛋白质和碳水化合物含量分别减少了16%和14%，但酶特异性水解进一步放大了这些减少，突出了酶特异性在去除抑制性成分中的关键作用。碳水化合物酶，特别是Viscozyme? L和果胶酶，通过选择性降解多糖，在增强TRPE功能性方面表现出卓越的功效。Viscozyme? L处理使碳水化合物含量减少74%（34 g·kg^-1），多酚减少55%（22 g·kg^-1），直接破坏了果胶-蛋白质-多酚网络。这与果胶作为物理屏障的假设一致，它包裹疏水蛋白结构域，限制了乳化能力。类似地，果胶酶迅速减少了碳水化合物（64 g·kg^-1），而纤维素酶表现出短暂的有效性， prolonged 水解由于纤维素降解不完全而产生抑制性中间体。相比之下，蛋白酶如胃蛋白酶主要靶向蛋白质-多糖复合物，通过解聚交联的聚集体，使蛋白质含量减少16%（337 g·kg^-1），多酚减少49%（25 g·kg^-1）。碱性蛋白酶影响有限，强调了胃蛋白酶破坏这些复合物的独特能力。值得注意的是，TG在适度减少碳水化合物的同时保留了蛋白质含量（427 g·kg^-1），反映了其交联活动稳定了较大的多肽以抵抗透析。这些结果强调了一个关键的机制分歧：碳水化合物酶通过去除阻碍蛋白质灵活性和界面吸附的多糖来增强TRPE功能，而蛋白酶则面临过度水解和失稳的风险。茶渣中富含的多酚可以通过非共价力（如氢键、疏水相互作用）以及在某些情况下通过共价醌-氨基酸键与蛋白质强烈相互作用。这些相互作用可能掩盖疏水结构域并改变蛋白质构象，从而损害界面吸附和乳液稳定性。在本研究中，碳水化合物酶处理在透析后降低了多酚含量，表明部分破坏了这些抑制性相互作用。这种减少可能改善了蛋白质在油水界面的灵活性和可及性，与观察到的乳化活性指数和稳定性的增加一致。这些发现表明，调节多酚-蛋白质相互作用，作为更广泛结构变化的一部分，可以补充TRPE乳化性能的增强。

3.4. 透析对酶处理TRPE乳化特性的影响

透析显著调节了酶处理TRPE的乳化特性，碳水化合物酶在增强活性和稳定性方面表现出优于蛋白酶的功效。碳水化合物酶处理显示出显著的改善，特别是纤维素酶水解的TRPE，在0.5小时水解和透析后达到了52.4 m²·g^-1的最高EAI，与未透析的TRPE（30.7 m²·g^-1）相比增加了71%。这种增强可能源于靶向纤维素降解，它释放了疏水蛋白结构域并最小化了油水界面的空间障碍。木聚糖酶也表现出持续的性能，保持了15天的EAI为33.3 m²·g^-1，这归因于选择性去除了否则会阻碍蛋白质灵活性的半纤维素衍生的木糖。相比之下，果胶酶在透析后效果有限（30.4 m²·g^-1），表明残留的果胶片段可能仍然阻碍界面吸附。蛋白酶处理虽然在短期有效，但面临稳定性挑战。胃蛋白酶水解的TRPE在10小时后达到34.9 m²·g^-1的EAI，但稳定性在15天时急剧下降至24.7 m²·g^-1，反映了肽的过度水解和聚集。类似地，碱性蛋白酶表现出降低的稳定性（15天时24.5 m²·g^-1），强调了不受控蛋白水解的风险。值得注意的是，TG通过交联的蛋白质网络保持了中等稳定性（29.4 m²·g^-1），该网络抵抗了透析诱导的碎片化。这些结果表明，去除小肽或果胶对蛋白质乳化有负面影响。相比之下，去除低聚糖或低分子量糖，如木糖、阿拉伯糖和葡萄糖，抑制了蛋白质乳化特性的降低。去除阴离子多糖改善了蛋白质乳化稳定性，而去除其他低聚糖导致稳定性下降。此外，单糖，如半乳糖和甘露糖，通过糖基化改变了蛋白质分子灵活性、表面疏水性和自由基可用性，从而增强了蛋白质乳化特性。相比之下，葡萄糖对蛋白质乳化特性影响轻微。因此，纤维素酶诱导的TRPE乳化特性增强可能归因于其诱导蛋白质上更大的疏水区域暴露。与广泛报道的多糖在大豆蛋白乳液中的稳定作用相反，我们的结果表明，TRPE中的天然果胶和纤维素充当物理屏障，阻碍蛋白质吸附。只有通过酶促转化为低聚糖，这些碳水化合物才能通过增加粘度来促进乳液稳定性。

3.5. 透析对酶处理TRPE蛋白质结构的影响

3.5.1. 非共价作用力含量

透析在酶处理的TRPE中诱导了不同的分子间作用力谱，碳水化合物酶和蛋白酶表现出根本不同的机制。碳水化合物酶，特别是Viscozyme? L，将离子键对可溶蛋白浓度的贡献急剧降低至3.0 mg·L^-1（减少95%），氢键降低至1.2 mg·L^-1（减少98%），这直接归因于果胶降解破坏了多糖-蛋白质网络。这种靶向结构多糖的精确性保留了疏水相互作用的贡献（9.2 mg·L^-1），使得对乳化至关重要的功能性蛋白质结构域得以暴露。相比之下，纤维素酶和阿拉伯聚糖酶保持了高离子键贡献（66.6和66.1 mg·L^-1）和疏水相互作用（16.6和16.1 mg·L^-1），表明纤维素和阿拉伯聚糖的降解选择性地去除了抑制性多糖而没有破坏蛋白质内聚力。然而，木聚糖酶将疏水相互作用的贡献降低了67%（5.4 mg·L^-1），可能是由于半纤维素去除削弱了多酚介导的交联，突出了特定碳水化合物酶的细微影响。蛋白酶普遍 destabilized 分子间作用力。胃蛋白酶 aggressively 水解了离子键（7.2 mg·L^-1，减少89%）和氢键（6.4 mg·L^-1，减少90%）的贡献，反映了对肽-多糖复合物的非选择性切割。类似地，碱性蛋白酶减少了离子键（17.8 mg·L^-1，减少73%）和氢键（17.6 mg·L^-1，减少73%）的贡献，强调了蛋白酶破坏静电网络的趋势。值得注意的是，TG通过交联独特地增强了氢键的贡献（71.0 mg·L^-1，增加9%），但减少了疏水相互作用的贡献（9.0 mg·L^-1，减少46%），说明了结构稳定性和界面灵活性之间的权衡。

3.5.2. 蛋白质二级结构

透析显著重塑了酶处理TRPE的二级结构，碳水化合物酶和蛋白酶施加了不同的结构效应。碳水化合物酶通过靶向多糖降解来调节结构平衡。纤维素酶将β-折叠含量最大化至41.7%，与透析后的TRPE（35.5%）相比增加了6%，这可能是由于纤维素去除暴露了有利于β-折叠堆叠的疏水区域。Viscozyme? L和阿拉伯聚糖酶分别将α-螺旋比例增加了8%（20.6%）和9%（21.4%），同时提高了β-转角结构（19.5%和20.2%），表明部分多糖（如果胶、阿拉伯聚糖）去除促进了有序的螺旋折叠。然而，木聚糖酶保持了β-折叠的主导地位（36.8%），同时减少了α-螺旋（14.6%），反映了半纤维素降解诱导的刚性。蛋白酶和TG表现出不同的影响。碱性蛋白酶 drastically 增加了α-螺旋含量15%（27.2%），但使β-折叠崩溃至12.4%，表明激进的肽水解 destabilized 了天然折叠。胃蛋白酶适度提高了α-螺旋（18.3%），同时保留了β-折叠（31.7%），表明受控的蛋白水解保留了结构完整性。TG通过交联独特地增强了α-螺旋（24.3%，增加12%），但减少了β-折叠（21.7%），突出了稳定性和灵活性之间的权衡。透析后，低聚糖的去除减少了β-折叠含量（例如，TRPE_dia vs 未处理的TRPE），而残留的多酚或交联稳定了有序构象。这些发现强调，酶特异性——碳水化合物酶通过多糖降解释放结构灵活性，而蛋白酶通过肽切割改变稳定性——决定了二级结构的结果，将酶-透析协同作用定位为定制植物蛋白功能的关键策略。

3.5.3. 酶处理和透析后蛋白质结构与乳化特性的相关性分析

酶水解和透析诱导的结构变化显著影响了TRPE的乳化特性，在碳水化合物酶和蛋白酶之间观察到了不同的机制。碳水化合物酶，如纤维素酶和Viscozyme? L，选择性降解多糖（如纤维素和果胶），破坏多糖-蛋白质复合物并保留关键的分子间作用力。例如，纤维素酶处理保留了离子键（66.6 mg·L^-1）并最大化β-折叠含量（41.7%），形成致密的界面膜，增强了乳化活性（EAI: 52.4 m²·g^-1）和稳定性（86% CI）。相比之下，蛋白酶如胃蛋白酶非选择性地水解肽键，使离子键（减少89%）和氢键（减少90%）崩溃，同时增加无序的无规卷曲结构（37.5%）。这些结构破坏导致液滴聚集（D(4,3) = 25 nm）和乳液稳定性降低（ESI: 70.7%）。透析通过去除低分子量组分进一步调节了这些效应。对于碳水化合物酶，去除残留的多糖片段（如果胶低聚物）增强了β-折叠形成（纤维素酶增加6%）和界面吸附。例如，Viscozyme? L处理减少了离子键（3.0 mg·L^-1）和氢键（1.2 mg·L^-1），增加了α-螺旋含量（20.6%），以改善结构灵活性（EAI: 39 m²·g^-1）。相反，蛋白酶处理的TRPE在透析后表现出不可逆的分子间作用力损失。胃蛋白酶将离子键降低至7.2 mg·L^-1，驱动向α-螺旋（18.3%）和无规卷曲（37.5%）的转变，这与乳化效率降低相关。结构-乳化相关性强调了关键的机制见解。高β-折叠含量（例如，纤维素酶：41.7%）促进了稳定的界面网络，与改善的EAI和析乳稳定性一致。相比之下，α-螺旋结构与EAI呈负相关，因为它们的刚性限制了界面适应性。无规卷曲的积累（与稳定性的相关性为-0.699）通过促进