溶菌酶与香芹酚协同抗沙门氏菌机制：通过破坏TCA循环和氨基酸利用增强食品安全

本研究针对溶菌酶(LYZ)单独使用对革兰阴性菌(如沙门氏菌)杀菌效果有限的问题，通过联合天然植物精油成分香芹酚(Car)，系统揭示了LYZ-Car复合物通过破坏细胞膜完整性、升高活性氧(ROS)水平、抑制ATP酶活性及ATP含量，并显著干扰三羧酸(TCA)循环和氨基酸代谢通路，从而协同增强抗菌效果的分子机制，为开发天然复合抗菌剂提供了重要理论依据。

　　

在食品安全领域，沙门氏菌(Salmonella)污染一直是重大威胁。虽然蛋清来源的溶菌酶(Lysozyme, LYZ)作为天然抗菌蛋白对革兰阳性菌效果显著，但其对革兰阴性菌的抑制作用却因细菌外膜中脂多糖的屏障作用而大打折扣。为了突破这一局限，以往研究尝试通过共价修饰改造LYZ分子结构，但往往导致酶活性显著下降。与此同时，植物精油成分香芹酚(Carvacrol, Car)被证实能有效增加细菌外膜通透性，但其与LYZ的协同作用机制，特别是在代谢层面的影响，仍不明确。

针对这一科学问题，贵州医科大学公共卫生学院的研究团队在《LWT》期刊上发表了一项创新性研究，系统阐明了LYZ与Car联合使用对沙门氏菌的协同杀菌机制及其代谢基础。

研究团队通过平板菌落计数、生长曲线分析和扫描电子显微镜(SEM)观察，证实LYZ-Car组合能显著抑制沙门氏菌生长并造成严重形态学损伤。机制研究表明，联合处理使细菌外膜通透性提高约1.6倍，细胞内活性氧(ROS)水平升高1.9倍。同时，ATP酶活性和ATP含量分别被抑制1.5倍和1.4倍，表明能量代谢受到严重破坏。通过液相色谱-质谱(LC-MS)代谢组学分析，研究人员鉴定出129种显著改变的代谢物，发现16条关键代谢通路受到深刻干扰，其中氨基酸代谢和三羧酸(TCA)循环受影响最为严重。

研究采用了几项关键技术方法：通过扫描电镜(SEM)观察细菌形态结构变化；使用N-苯基-1-萘胺(NPN)荧光探针检测外膜通透性；采用DCFH-DA荧光探针测定细胞内活性氧(ROS)水平；通过超微量ATP酶检测试剂盒测定ATP酶活性；利用化学发光法检测细胞内ATP含量；应用基于LC-MS的全面靶向代谢组学技术分析代谢物变化，样本来源于中国普通微生物菌种保藏中心提供的鼠伤寒沙门氏菌CGMCC1.1859(原ID: ATCC14028)。

3.1. LYZ-Car协同抗菌效应

通过平板计数和生长曲线分析发现，随着Car浓度增加，沙门氏菌存活数量呈下降趋势。0.1 mM LYZ与1.2 mM Car组合使用时，杀菌活性显著增强。生长曲线显示，LYZ单独使用对沙门氏菌生长无显著抑制，而添加Car后，LYZ对沙门氏菌对数生长期表现出明显抑制作用。

3.2. LYZ-Car协同损伤沙门氏菌细胞膜

3.2.1. 沙门氏菌细胞表面结构损伤

SEM观察显示，LYZ单独处理组细菌形态结构完整，表面损伤极小；而Car单独处理或LYZ-Car联合处理组均出现显著的形态学变化，如细胞表面凹陷和胞内物质泄漏。联合处理组细菌失去原有杆状结构，伴随胞内物质泄漏，表明对细胞结构造成更严重损伤。

3.2.2. 沙门氏菌外膜通透性变化

NPN含量测定表明，与对照组(CK)相比，LYZ组细菌外膜通透性无显著变化，Car组呈上升趋势，而LYZ-Car联合处理组外膜通透性增加最为显著(P < 0.01)，外膜选择性通透性大幅降低，胞内物质泄漏可能性最高。

3.3. LYZ-Car协同破坏沙门氏菌细胞能量供应

3.3.1. 沙门氏菌细胞内活性氧(ROS)积累

荧光探针检测发现，LYZ处理组与CK组相比，ROS积累无显著差异；而Car单独处理和LYZ-Car联合处理均使细菌细胞内ROS含量显著增加。值得注意的是，Car单独处理引起的ROS含量增加显著高于LYZ-Car联合处理。

3.3.2. 沙门氏菌细胞内ATP酶活性

ATP酶活性测定显示，LYZ、Car和LYZ-Car处理后，沙门氏菌细胞ATP酶活性均出现一定程度降低。LYZ-Car可能影响天然ATP酶蛋白构象，这种变化可能影响ATP酶活性位点，从而干扰沙门氏菌细胞活性。

3.3.3. 沙门氏菌细胞内ATP水平变化

ATP含量检测表明，LYZ、Car和LYZ-Car处理后，沙门氏菌细胞内ATP含量均有不同程度下降，其中LYZ-Car处理引起下降最为显著。这表明LYZ-Car处理可能严重破坏细菌能量代谢过程。

3.4. 全靶向代谢组学的多元统计分析和基础分析

研究成功在正负离子模式下从沙门氏菌细胞中鉴定出2967种代谢物。主成分分析(PCA)显示，CK组与三个实验处理组(LYZ组、Car组和LYZ-Car组)之间存在显著差异，处理组间也存在差异。层次聚类分析证实处理组代谢物相对丰度与CK组显著不同。对2967种代谢物进行分类分析发现，60种羧酸及其衍生物占比最高，达35.29%；29种有机氧化物占17.06%；27种脂肪酸代谢物代表15.88%。

3.5. 差异代谢物分析

通过统计学检验方法共鉴定出299种差异次级代谢物。LYZ与CK组比较发现96种差异代谢物，其中41种下调，55种上调；Car与CK组比较发现153种代谢物改变，74种下调，79种上调；LYZ-Car与CK组比较鉴定出129种差异代谢物，其中30种下调，99种上调。

3.6. KEGG代谢通路分析

对CK和LYZ-Car组的差异代谢物列表进行KEGG通路富集分析发现，16条通路中的大多数代谢物呈现表达上升趋势，而2条通路中的所有鉴定代谢物呈现表达下降趋势。以P < 0.05筛选发现，ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统(PTS)、D-氨基酸代谢、赖氨酸降解和氨酰-tRNA生物合成等代谢通路显著富集。氨基酸代谢通路在16条具有生物学意义的代谢通路中数量最多。

3.7. LYZ与Car协同解决沙门氏菌TCA循环异常

TCA循环代谢物单独分析发现，LYZ-Car组中乙酰磷酸含量显著降低，而草酰乙酸含量变化不大。乙酰磷酸是乙酰辅酶A合成的前体，其水平降低可能影响TCA循环。从产能角度看，异柠檬酸向α-酮戊二酸和琥珀酰辅酶A向延胡索酸的转化是TCA循环中能量产生的关键步骤。LYZ-Car联合处理组中异柠檬酸水平显著降低，而延胡索酸、琥珀酸和卟啉原水平显著增加。

3.8. LYZ与Car协同解决沙门氏菌氨基酸代谢异常

在CK和LYZ-Car组的代谢通路分析中，发现6条氨基酸代谢通路受到影响。苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)生物合成通路中代谢物水平显著上调，表明沙门氏菌加速生物活性物质产生以应对环境胁迫。精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)代谢通路中代谢物整体呈上升趋势，表明沙门氏菌细胞可能无法进行氮代谢，导致氨毒性。赖氨酸(Lys)降解通路代谢物也呈现上升趋势，表明沙门氏菌经过一系列氧化、脱羧和转氨基反应。甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)代谢中，肌酸显著减少，可能削弱细胞抗氧化能力。半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)代谢受到影响，表明细胞抵抗外部胁迫的能力可能下降。

研究结论表明，LYZ与Car组合对沙门氏菌表现出强烈的协同抗菌作用，显著增强膜通透性，诱导结构损伤，提高细胞内ROS水平，并破坏能量代谢。代谢组学分析进一步揭示了TCA循环和氨基酸代谢通路的深刻干扰，为LYZ-Car复合物的抗菌作用机制提供了新的见解。

尽管取得了这些令人鼓舞的结果，但研究仍存在一定局限性。实验在受控实验室条件下进行，可能无法完全模拟复杂食品基质。此外，代谢组学数据反映的是静态快照而非实时动态变化，Car在食品产品中的潜在感官影响仍有待解决。

未来研究应着重在真实食品系统(如禽肉、肉类或即食产品)中验证这些发现。时间分辨的多组学方法可进一步解读细菌对联合处理的动态代谢反应。此外，探索包封技术以减轻香芹酚的风味影响，以及将组合扩展到其他天然抗菌剂，可能促进实际应用。最后，毒理学和体内功效研究对于确保商业使用前的安全性和有效性至关重要。

这项工作为开发新型天然防腐策略提供了理论基础，并通过多靶点抗菌干预为增强食品安全做出了贡献。