乳酸菌新型抗菌肽的基因组挖掘与功能表征：从传统发酵食品到生物防腐应用

本研究针对食品微生物污染问题，从波兰传统发酵食品中分离出两株乳酸菌（Lacticaseibacillus paracasei B1和Lactiplantibacillus plantarum O24），通过全基因组测序和生物信息学分析预测了多种细菌素基因，实验验证了其产生的蛋白类抗菌物质对单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7等食源性病原体的抑制活性，并证实了这些抗菌物质的热稳定性和pH稳定性。该研究为开发新型天然食品防腐剂提供了重要资源，对保障食品安全和减少化学防腐剂使用具有重要意义。

　　

在当今食品工业中，微生物污染仍然是困扰全球的严峻问题。尽管食品安全生产技术和保存方法不断进步，但微生物污染依然频发，对公众健康和食品产业构成重大风险。传统化学防腐剂虽然有效，但由于潜在的健康风险和环境影响，引发了越来越多的担忧。因此，市场对"绿色"天然防腐剂的需求日益增长，这些防腐剂能够在保障食品安全的同时，不损害健康和环境。

乳酸菌(LAB)作为一类革兰氏阳性、不产孢的微需氧微生物，主要通过葡萄糖发酵产生乳酸。这些细菌在食品工业中作为发酵剂或辅助剂广泛应用，能够赋予食品产品理想的特性。乳酸菌以其产生多种抗菌化合物而闻名，包括有机酸、过氧化氢和细菌素。它们常见于发酵食品中，在食品保存方面有着悠久的安全使用历史。它们抑制腐败和病原微生物生长的潜力，使其在延长各种食品产品的保质期方面具有不可估量的价值。

在乳酸菌产生的物质中，抗菌肽(AMPs)如细菌素和类细菌素抑制物质(BLIS)因其强效的抗菌特性而脱颖而出。细菌素是核糖体合成的具有杀菌特性的肽，通常显示出狭窄的活性谱，仅限于与生产菌株密切相关的物种。尽管它们具有潜力，但目前只有两种细菌素——片球菌素PA1和乳酸链球菌素——实现了商业化，部分原因是监管障碍。商业细菌素的有限可用性凸显了继续从多样化的乳酸菌菌株中探索和发现新细菌素的必要性。

在这项研究中，研究人员评估了先前从波兰传统发酵食品产品中分离出的两株乳酸菌菌株的抗菌活性，并验证了这些细菌产生的抗菌化合物的蛋白质性质。此外，还对这两株菌株进行了全面的基因组分析、细菌素相关基因的预测，并对产生的化合物的抗菌活性和稳定性以及理化性质进行了评估，以促进乳酸菌细菌素相关产品的研究和开发。

研究人员采用的主要技术方法包括：全基因组测序(采用牛津纳米孔技术)、生物信息学分析(使用BAGEL4等软件预测细菌素基因)、细胞培养和上清液制备、琼脂扩散法测定抗菌活性、温度和pH稳定性测试、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析、硫酸铵沉淀和透析纯化、SDS-PAGE分子量估计以及LC-MS/MS蛋白质鉴定。菌株来源为波兰传统发酵食品(其中B1菌株分离自喀尔巴阡地区生产的Bundz奶酪，O24菌株分离自家庭自制腌黄瓜)。

基因组分析结果

全基因组测序显示，菌株B1(副干酪乳杆菌)的基因组由一个染色体(3,113,638 bp，46.24% G+C)和一个质粒(26,855 bp，43.46% G+C)组成。在染色体中发现了一个糖肽耐药基因簇(vanT)，这与乳酸菌中由于修饰的肽聚糖前体而已知的固有万古霉素耐药性一致。研究人员确定了62个推定的水平基因转移(HGT)事件和159个移动遗传元件(MGE)相关区域，其中45个区域与噬菌体相关。还检测到了七个CRISPR阵列和四个Cas基因，包括染色体中一个完整的II-A型CRISPR-Cas簇(6142 bp)。

菌株O24(植物乳杆菌)的基因组由一个染色体(3,126,794 bp，44.71% G+C)和八个质粒组成。在染色体中鉴定出两个ARG：vanH和vanY，均与万古霉素耐药相关。预测了61个推定的HGT事件和125个MGE相关区域，其中41个区域与噬菌体相关。检测到一个CRISPR阵列(198 bp)，但未发现Cas基因。在染色体中鉴定出三个原噬菌体区域，包含95个基因。

细菌素相关基因预测结果

对副干酪乳杆菌B1菌株的分析显示，染色体中存在12个基因区域，其蛋白质产物具有细菌素特性。BAGEL4搜索预测了两个关注区域(AOIs)，其中包含推定的抗菌物质生物合成基因簇。第一个细菌素生物合成基因簇(BBCG)是AOI_1(24,245 bp)，包含76个ORF和七个核心肽，而第二个BBCG是AOI_02(20,180 bp)，包含45个ORF和一个核心肽。

在植物乳杆菌O24菌株的基因组中也搜索了与细菌素生产相关的基因。基于RefSeq v6.7 (GCF)基因组组装的分析显示，染色体中存在13个基因区域，质粒pLplO24_7中存在2个基因区域，其蛋白质产物具有细菌素特性。BAGEL4搜索预测了两个AOIs，其中一个位于细菌染色体中，一个位于质粒pLplO24_7中。

细菌制备物的理化性质

所有测试的细菌制备物对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均表现出抑制效果。副干酪乳杆菌B1菌株的无细胞上清液(CFS)对单增李斯特菌ATCC 19111和大肠杆菌O157:H7 ATCC 10536显示出最强劲的活性，抑菌圈直径分别为12.2 ± 1.0 mm和12.7 ± 1.9 mm。植物乳杆菌O24菌株的CFS也表现出对这两种病原体的抑制活性。

所有测试的CFS表现出良好的热稳定性，在100°C处理20分钟后仍保留约70%的残余抗菌活性。然而，当样品在121°C灭菌20分钟后，观察到显著的活性损失。测试的CFS的抗菌活性在用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K等酶处理后消失，表明细菌提取物中存在的活性化合物具有蛋白质性质。

光谱分析结果

傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析用于鉴定副干酪乳杆菌B1菌株和植物乳杆菌O24菌株的CFS制备物中的官能团。在3400.41 cm^-1至3386.34 cm^-1之间出现了宽吸收带，这些谱带与氢键有关，可能连接到官能团如-OH、-NH和-COOH。在1612.15 cm^-1至1608.41 cm^-1的峰归因于C=O伸缩振动，这些是酰胺中羰基的特征，与酰胺I带一致，是FT-IR光谱中蛋白质的关键指标。

蛋白质物质的纯化和分子量估计

测试CFS中的蛋白质物质采用两步策略进行纯化，包括硫酸铵沉淀和透析。副干酪乳杆菌B1菌株和植物乳杆菌O24菌株的无细胞上清液经过硫酸铵沉淀，分别获得了4.00%和3.14%回收率的粗提取物，比活性分别为251.47 AU/mg和167.36 AU/mg。然后通过透析进一步纯化粗提物，抗菌活性分别为402.67 AU/mg和387.94 AU/mg，产率分别为3.20%和3.64%，与原始CFS相比，分别提高了3.38倍和4.06倍。

使用SDS-PAGE估计了潜在细菌素的分子量。装载有副干酪乳杆菌B1菌株和植物乳杆菌O24菌株制备物的染色凝胶显示单一条带，分别约为14-15 kDa和10-11 kDa。然后切除这两个特定条带进行质谱分析。通过LC-MS/MS分析的副干酪乳杆菌B1菌株和植物乳杆菌O24菌株产生的潜在细菌素或类细菌素抑制物质的预测分子量分别为15,079 Da和10,815 Da，与电泳结果一致。

研究结论与意义

本研究从波兰传统发酵食品中分离出的两株乳酸菌——副干酪乳杆菌B1和植物乳杆菌O24，对常见的食源性病原体表现出广谱抗菌活性。基因组分析揭示了多个细菌素相关基因，而蛋白质组学数据证实了蛋白质类化合物的生产，这些化合物在一定的pH值和温度范围内稳定，但对蛋白酶敏感。SDS-PAGE和LC-MS/MS鉴定出了与已知序列显示部分同源性的独特肽，表明它们可能代表新的细菌素或类细菌素物质。

这些发现突出了这两种菌株作为新型抗菌剂来源的生物技术潜力，需要进一步的纯化和功能研究来支持其在食品保存和抗菌治疗中的应用。该研究为开发新型天然食品防腐剂提供了重要资源，对解决食品微生物污染问题、减少化学防腐剂使用以及保障食品安全具有重要意义。研究结果发表在《LWT-Food Science and Technology》期刊上，为食品科学领域提供了有价值的科学数据和应用前景。