使用光学探针检测动脉粥样硬化小鼠和临床样本中的天冬氨酰氨基肽酶

《Materials Today Bio》：Detection of aspartyl aminopeptidase in atherosclerosis mice and clinical sample using an optical probe

动脉粥样硬化（AS）严重威胁心血管健康，DNPEP酶在AS进程中起关键作用。本研究成功开发新型光学成像探针HD-DNPEP，通过酶-探针特异性结合实现“荧光增强-光声信号”双模检测，灵敏度达0.016 mg/L，在细胞模型和 ApoE-/-小鼠中验证其与泡沫细胞成熟及斑块进展的强相关性，并首次在人类AS患者脑血管和脑脊液中检测到DNPEP显著升高。该探针为AS诊断和疗效监测提供新工具。

　　动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是全球范围内的重大健康问题，其与心血管疾病的发病率和死亡率密切相关。作为一种慢性疾病，动脉粥样硬化主要表现为动脉壁内脂质沉积、炎症细胞聚集以及纤维组织形成，从而导致斑块形成和血管狭窄。这种病理过程不仅增加了心脏病发作、中风和外周动脉疾病等严重心血管事件的风险，还成为全球公共卫生关注的焦点。尽管在预防和治疗方面已有显著进展，但动脉粥样硬化的诊断和干预仍面临诸多挑战，尤其是在灵敏度、特异性和体内检测能力方面。因此，开发一种能够精准识别动脉粥样硬化病变中特定酶活性的新型成像工具显得尤为重要。

近年来，科学家们对多种酶和生物标志物在动脉粥样硬化发生发展中的作用进行了深入研究，其中天冬氨酸氨基肽酶（DNPEP）因其在调节蛋白代谢、细胞信号传导和免疫反应中的潜在功能而受到广泛关注。研究表明，DNPEP在动脉粥样硬化病变中的表达水平显著升高，提示其可能作为检测动脉粥样硬化的生物标志物。基于这一发现，本研究致力于开发一种新型的光学成像探针——HD-DNPEP，旨在实现对DNPEP表达的高灵敏度、高特异性检测，同时提升体内成像的能力。通过结合高灵敏度的荧光和光声（PA）成像技术，HD-DNPEP探针有望为动脉粥样硬化的早期诊断和治疗监测提供新的视角。

HD-DNPEP探针的设计基于对DNPEP底物的特异性识别，通过将HD-SO?H与特定的DNPEP底物结合，构建出具有功能性的成像探针。该探针的合成过程通过核磁共振（NMR）和质谱（MS）进行了详细表征，确保了其结构的准确性和化学性质的稳定性。在未激活状态下，HD-DNPEP探针表现出较弱的荧光和光声信号，这是由于其分子结构中存在一种抑制内分子电荷转移（ICT）效应的机制。然而，当DNPEP与其结合后，该抑制机制被解除，探针能够释放出强烈的荧光和光声信号，从而实现“开启”式的响应模式。这一特性使得HD-DNPEP成为一种具有高选择性和灵敏度的酶活性检测工具，能够在生理pH范围内保持稳定，适用于定量分析。

在细胞实验中，HD-DNPEP探针被用于检测泡沫细胞（foam cells）中DNPEP的表达情况。泡沫细胞是动脉粥样硬化过程中形成的脂质积累细胞，其成熟程度与DNPEP的表达水平密切相关。实验结果显示，随着泡沫细胞的成熟，HD-DNPEP探针的荧光信号显著增强，表明其能够有效识别DNPEP在细胞内的活性变化。此外，探针在不同浓度和时间条件下对泡沫细胞的响应具有良好的线性关系，进一步验证了其作为DNPEP活性检测工具的可靠性。这种细胞水平的检测能力为理解DNPEP在动脉粥样硬化中的作用提供了重要的实验依据。

在动物模型中，HD-DNPEP探针被用于评估其在体内对动脉粥样硬化斑块的检测效果。实验采用ApoE?/?小鼠作为动脉粥样硬化模型，这些小鼠在高脂饮食喂养16周后表现出明显的动脉粥样硬化病变。通过静脉注射HD-DNPEP探针，并结合光声成像技术，研究人员能够在不同时间点（如注射后5分钟、60分钟和90分钟）捕捉到斑块的动态变化。结果显示，与健康对照组相比，动脉粥样硬化小鼠的光声信号强度显著增加，尤其是在注射后60至90分钟时，信号强度超过对照组的两倍以上。这表明HD-DNPEP探针能够有效检测DNPEP在动脉粥样硬化病变中的活性，为疾病的早期诊断和实时监测提供了技术支撑。

为了进一步验证HD-DNPEP探针的临床应用潜力，研究团队还进行了人体样本的检测。他们收集了患有动脉粥样硬化脑血管疾病患者的脑脊液（CSF）样本，并与健康个体的CSF样本进行对比。结果显示，动脉粥样硬化患者的CSF中DNPEP的表达水平显著高于健康对照组，这为DNPEP作为脑血管动脉粥样硬化的生物标志物提供了有力证据。此外，研究人员还采集了患有脑血管动脉粥样硬化病变患者的脑血管组织样本，并与良性脑肿瘤患者的脑血管组织样本进行比较。HD-DNPEP探针在动脉粥样硬化患者的脑血管组织中表现出更强的荧光信号，进一步支持其在临床检测中的应用前景。

为了确保HD-DNPEP探针的安全性和适用性，研究团队还进行了广泛的毒理学评估。通过检测主要器官（如肝脏、肾脏）的功能指标，研究人员发现HD-DNPEP在体内具有良好的生物相容性，不会引起显著的器官毒性。例如，肝功能测试显示，注射HD-DNPEP后，血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平均在正常范围内，表明肝脏未受到明显损伤。同样，肾功能测试也显示血清中的血尿素氮（BUN）和肌酐（CR）水平无显著变化，进一步验证了探针的安全性。此外，通过完整的血液分析和生化指标检测，研究团队确认HD-DNPEP在体内的应用不会导致明显的生物毒性，为未来临床转化奠定了基础。

除了对DNPEP的检测能力，HD-DNPEP探针还表现出良好的组织穿透能力，这对于体内成像尤为重要。实验结果显示，随着组织厚度的增加，探针的荧光和光声信号逐渐减弱，这表明其在深层组织中的检测能力受到一定限制。然而，光声成像技术由于其良好的穿透深度，能够在较厚组织中保持较高的信号强度，为深入研究动脉粥样硬化病变提供了技术优势。这一特性使得HD-DNPEP探针不仅适用于浅表组织的检测，还能用于体内较深部位的成像，拓展了其应用范围。

此外，研究团队还通过多种生物标志物的检测，进一步评估了动脉粥样硬化模型的病理特征。例如，通过测量血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平，研究人员发现动脉粥样硬化小鼠的血脂水平显著升高，而HDL-c水平则下降。这些变化与动脉粥样硬化的病理机制高度吻合，表明HD-DNPEP探针能够准确反映疾病状态下的代谢变化。同时，通过检测氧化应激相关指标，如丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，研究团队进一步揭示了DNPEP在动脉粥样硬化过程中对炎症反应和氧化损伤的调节作用。

本研究不仅在实验室环境中验证了HD-DNPEP探针的性能，还在动物模型和人体样本中进行了广泛的临床验证。通过结合光声成像和荧光成像技术，研究人员能够实时监测DNPEP在不同组织和体液中的表达情况，为动脉粥样硬化的早期诊断和治疗评估提供了新的工具。此外，HD-DNPEP探针的开发为探索DNPEP在动脉粥样硬化中的具体作用机制提供了重要线索，有助于发现新的治疗靶点，从而推动更有效的疾病干预策略。

综上所述，HD-DNPEP探针的开发为动脉粥样硬化的研究和临床应用带来了新的突破。其高灵敏度和特异性使其能够精准检测DNPEP在病变组织中的表达情况，同时其良好的组织穿透能力和安全性为体内成像提供了可靠的技术支持。未来，随着该探针的进一步优化和临床应用的推广，有望为动脉粥样硬化的诊断、治疗监测以及疾病机制研究提供重要的工具，从而改善患者的预后并提升整体医疗水平。