基于天然肽共聚单体的即时抗菌骨水泥保护骨科植入物免受细菌侵袭

本研究针对抗生素骨水泥(ALBC)存在的暴释、机械强度下降及细菌耐药性等问题，开发了一种基于乳酸链球菌素(Nisin)的即时(POC)抗菌聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥。通过将含脱氢丙氨酸(Dha)的天然抗菌肽共价固定于骨水泥基质，实现了高达98%的抗菌率、70 MPa以上的机械强度（符合ASTM F451标准）以及良好的体外体内生物相容性。该技术原材料商业可得，操作流程与临床骨水泥完全兼容，为预防假体周围感染(PJI)提供了创新性解决方案。

　　

随着全球人口老龄化和战争创伤的增加，每年进行数百万例全关节置换术(TJA)。假体周围感染(PJI)作为TJA的严重并发症，是翻修手术最常见的原因之一，其术后5年死亡率高达20%-30%，甚至超过许多癌症，给医疗系统带来沉重负担。为降低PJI风险，抗生素负载聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥(ALBC)被广泛使用。然而经过数十年应用，ALBC暴露出诸多缺陷：高聚合温度、聚合后收缩、特别是抗生素释放行为不理想——通常在植入后几小时内发生暴释，高剂量抗生素不仅具有细胞毒性、阻碍成骨活性，更严重的是暴释使得有效抗生素释放仅维持一周，随后残留抗生素不足以抑制细菌，极易导致细菌耐药性发展，无法提供长期保护。此外，抗生素簇从ALBC中洗脱后形成大量空隙，导致压缩强度低于ASTM标准规定的70 MPa最低阈值，可能需要进行二次手术。这些局限性严重削弱了ALBC预防感染的效能。

近日，合肥工业大学食品与生物工程学院的研究团队在《Materials Today Bio》发表了一项创新研究，开发了一种基于天然抗菌肽乳酸链球菌素(Nisin)的即时(POC)抗菌骨水泥技术，为解决上述难题提供了新方案。

研究人员采用了几种关键技术方法：通过高效液相色谱(HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析Nisin的热稳定性和固定化效果；依据ASTM F451标准使用材料试验机测试骨水泥的压缩强度和弹性模量；采用扫描电子显微镜(SEM)观察水泥断面形貌和细菌形态；通过体外抑菌环试验和细菌计数评估抗菌活性；使用CCK-8法和溶血试验评价生物相容性；建立大鼠股骨植入感染模型进行体内抗菌效能验证；并采用临床常用骨水泥品牌(Heraeus和Eurofix)进行操作性验证。

3.1. Nisin基骨水泥的制备与表征

研究人员利用商业可得且廉价的Nisin（含2.5%活性肽，主要为Z型）作为天然共聚单体，因其含有未结合的脱氢丙氨酸(Dha)残基，可作为反应位点共价固定于PMMA骨水泥基质中。通过模拟PMMA聚合放热条件证实Nisin结构稳定性后，制备了不含药物的裸PMMA骨水泥和含2.5%、5%、10%Nisin的三种骨水泥。力学测试显示所有配方压缩强度均超过70 MPa（ASTM标准要求），老化7天后强度虽略有下降但仍高于70 MPa。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)显示所有骨水泥在2950、1730、1244和1150 cm^-1处具有丙烯酸骨水泥的特征峰。接触角测试表明添加Nisin后骨水泥亲水性增加（接触角从89°降至73°），表面粗糙度变化不大。扫描电镜(SEM)显示所有骨水泥断面光滑且分布有圆形气孔，随着Nisin添加量增加，气孔数量增多（因需要更长时间搅拌），但浸泡7天后未发现药物洗脱形成的空隙，与传统庆大霉素负载骨水泥(GS cement)形成鲜明对比，证实Nisin共聚单体成功固定于水泥基质中。

3.2. 体外抗菌活性

HPLC分析证实Nisin水泥浸提液中无Nisin洗脱，抑菌环试验显示无扩散性抗菌物质，表明Nisin共聚单体未从水泥中释放。将细菌在不同水泥样品上培养6小时后平板计数，发现Nisin水泥抗菌活性显著增强且与共聚单体含量成正比：2.5%和5%Nisin水泥抗菌率超90%，10%Nisin水泥接近100%。老化试验显示水泥抗菌活性随老化时间延长而下降，但10%Nisin水泥在老化7天和14天后抗菌率仍分别高达85%和近50%。令人惊喜的是，对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，对多种碳青霉烯类抗生素和庆大霉素耐药)，10%Nisin水泥抗菌率达66.05±1.15%，2.5%和5%Nisin水泥也超50%。SEM观察发现金黄色葡萄球菌在PMMA上保持正常球形，而在Nisin水泥上细胞壁收缩变形，表明表面固定的Nisin共聚单体对细菌具有破坏作用。

3.3. 细胞毒性、溶血活性和体外矿化

所有水泥溶血活性均低于5%，无溶血性。CCK-8法检测小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活性显示，Nisin水泥与PMA水泥的相对生长率(RGR)无显著差异且均大于75%，表明引入Nisin未引起细胞毒性。模拟体液(SBF)浸泡实验显示5%Nisin水泥表面形成显著生物矿化层，能谱分析(EDS)显示P和Ca峰增强，可能因Nisin富含赖氨酸和组氨酸等阳离子残基，可优先吸附溶液中的磷酸盐(PO₄^3-)，随后捕获Ca²⁺形成初始前体核，而PMMA水泥仅显示痕量Ca和P信号（归因于表面残留SBF离子），表明Nisin水泥具有良好的矿化活性。

3.4. 体外成骨分化

人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)在Nisin水泥上的增殖和细胞毒性试验显示，第1、3、5天所有Nisin水泥与裸PMMA水泥相比均未引起hBMSCs增殖下降或细胞毒性。成骨诱导14天后，碱性磷酸酶(ALP)活性检测显示所有水泥均表现出ALP活性，定量分析表明添加Nisin对裸PMMA水泥的ALP活性无影响。茜素红S(ARS)染色显示添加Nisin后骨水泥增强了细胞基质矿化，且矿化与Nisin比例正相关。qRT-PCR分析成骨相关基因表达显示，与PMMA水泥相比，仅10%Nisin水泥的ALP基因表达与PMMA相近，而其他组的Runx2和ALP成骨分化相关基因表达均下降。Western blotting检测显示5%Nisin水泥的Runx2表达水平与PMMA水泥相似，所有Nisin水泥的ALP表达与PMMA水泥相似，表明基因转录和蛋白翻译存在时间差，添加Nisin不会促进惰性PMMA水泥的成骨分化，但也不会产生不利影响。

3.5. 体内生物相容性

小鼠急性毒性试验显示所有小鼠无昏迷、休克、呕吐、腹泻等症状，体重均增加，第3天无显著差异。与生理盐水组相比，PMMA水泥和Nisin水泥均未损伤肝小叶和肾小球正常结构，无炎症细胞或肝肾功能细胞坏死。大鼠背部肌肉植入试验显示，植入2周后骨水泥周围肌肉区域观察到少量炎症细胞，表明植入后肌肉组织存在轻度早期炎症反应；4周和8周后各组炎症细胞数量减少，表明炎症反应程度减轻，是组织愈合的积极迹象。Nisin水泥与PMMA一样具有优异的组织相容性，添加Nisin不会诱导毒性。

3.6. 体内抗菌活性

建立大鼠股骨植入感染模型，将每块骨水泥在0.5×10⁸ CFU/mL金黄色葡萄球菌菌液中浸泡6小时后直接植入动物体内。植入PMMA水泥的大鼠植入部位出现化脓性肿胀，而植入Nisin水泥的大鼠无此现象。2周后取出水泥棒进行超声振动去除附着细菌，稀释培养计数发现PMMA水泥表面和周围组织中存在大量活菌，而Nisin水泥表面和周围组织的抗菌效率高达99%。白细胞(WBC)计数监测显示，由于植入物相关感染，PMMA组WBC计数达5.4-7.4×10⁹ cells·L^-1；植入12天后，Nisin水泥显著降低大鼠WBC计数至3.8-4.0×10⁹ cells·L^-1，基本恢复正常水平。肝肾脏器组织学分析显示Nisin水泥无明显毒副作用。

3.7. 转化应用示范

使用临床常用Heraeus骨水泥在手术室进行关节假体置换演示：将骨水泥固相与Nisin放入碗中，按固液比2:1加入液相，搅拌1分钟，将面团期骨水泥转移到关节和关节假体表面，植入假体并固定于关节面，去除多余水泥完成假体置换。整个过程符合临床操作，可在无菌条件下轻松完成。将5%Nisin加入两个品牌的临床骨水泥后，其抗菌率增强至95%以上（Heraeus为95.09±0.66%，Eurofix为98.92±0.17%），添加Nisin对凝固时间和聚合温度几乎无影响，两个商业水泥的机械强度与裸水泥相比无差异。在椎体成形应用方面，Nisin水泥展现出优异的可注射性、填充性和防漏性。

该研究开发的基于天然肽共聚单体的即时抗菌骨水泥技术，通过将Nisin共价固定于PMMA基质，成功解决了传统ALBC的抗生素暴释、机械强度下降和细菌耐药性问题。这种新型骨水泥不仅保持了符合临床标准的力学性能，还展现出持久高效的抗菌活性、良好的生物相容性和生物矿化能力。最重要的是，该技术所有原材料商业可得，操作流程与现有临床实践完全兼容，无需特殊培训即可由临床医生在手术室即时制备，具有极高的临床转化潜力。这项研究为预防假体周围感染提供了创新性解决方案，有望减少不必要的抗生素使用，推进全球抗生素管理进程。