排卵释放G-CSF诱导腹膜中性粒细胞浸润与NETosis形成促进高级别浆液性癌腹膜种植的机制研究

本研究针对高级别浆液性卵巢癌（HGSC）腹膜转移机制不清的问题，通过分析临床样本与小鼠模型，发现排卵期卵泡液（FF）中的G-CSF通过ROS/NOX/PAD4通路触发中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，促进癌细胞的锚定非依赖性生长和侵袭。该研究揭示了生理性排卵微环境对早期癌转移的推动作用，为HGSC的早期干预提供了新靶点。

　　

高级别浆液性卵巢癌（High-grade serous ovarian cancer, HGSC）是上皮性卵巢癌中最具侵袭性的亚型，多数患者确诊时已发生腹膜转移，预后极差。近年研究表明，HGSC可能起源于输卵管伞端的浆液性输卵管上皮内癌（Serous tubal intraepithelial carcinoma, STIC），但STIC细胞如何突破腹腔环境并实现种植转移的机制尚不明确。值得注意的是，输卵管伞端直接暴露于排卵过程中释放的卵泡液（Follicular Fluid, FF），而FF中富含的活性成分可能与恶性转化密切相关。这一生物学背景引出一个关键科学问题：生理性排卵是否通过调控免疫微环境，间接促进了早期癌细胞的腹腔播散？

为回答这一问题，来自花莲慈济医院妇科癌症防治研究中心的研究团队在《Neoplasia》发表了一项创新性研究。他们通过临床队列样本分析、小鼠模型实验及分子机制探析，系统揭示了排卵诱导的中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）形成在STIC细胞腹膜种植中的关键作用。研究不仅阐明了G-CSF/ROS/NOX/PAD4信号轴的核心地位，还验证了NETosis抑制剂的干预潜力，为HGSC的早期防治提供了新的理论依据和策略方向。

在研究过程中，作者运用了多种关键技术方法：首先，收集了不同排卵阶段女性和小鼠的腹腔液（Peritoneal Fluid, PF），通过流式细胞术分析免疫细胞组成；其次，利用体外NETosis诱导模型（如Sytox Green染色、Western blot检测PAD4和CitH3蛋白）评估NET形成；此外，通过锚定非依赖性生长（AIG）实验、细胞粘附与侵袭实验，以及体内小鼠腹腔种植模型（结合IVIS成像技术），全面评估了NETosis对癌细胞恶性表型的影响。关键样本来源包括人类IVF患者的卵泡液、输卵管上皮细胞（FE25）和HGSC细胞系（OVSAHO）。

研究结果

1. 1.
   排卵前后小鼠腹膜腔中性粒细胞浸润
   通过控制排卵周期并分析腹腔灌洗液，研究发现非排卵期小鼠腹腔中中性粒细胞比例极低（约5.4%），而排卵前和排卵期则显著升高至17.9%和22.5%，表明排卵事件直接触发中性粒细胞向腹膜腔的快速募集。
2. 2.
   女性LH峰后及排卵期间腹膜腔中性粒细胞浸润
   在人类样本中同样观察到类似规律：绝经后女性腹膜液中性粒细胞占比最低（13.6%），卵泡期升至22%，排卵前进一步跃升至39%。同时，排卵前腹膜中性粒细胞高表达NETosis关键酶PAD4，提示其处于激活状态。
3. 3.
   暴露于排卵期FF诱导中性粒细胞浸润与NETosis
   向小鼠腹腔注射10% FF可导致中性粒细胞数量在30分钟内激增15倍，且伴随PAD4蛋白水平和CitH3修饰的显著上升。体外实验中，人外周血中性粒细胞经FF处理后可快速激活（CD11b表达升高2.6倍）并形成NET纤维结构。
4. 4.
   FF中的G-CSF通过ROS/NOX/PAD4依赖途径激活NET
   细胞因子芯片显示FF中富含G-CSF、GRO、MCP-1等中性粒细胞趋化因子。其中，仅G-CSF在FF浓度范围内可诱导PAD4表达和DNA释放。机制上，G-CSF通过激活NADPH氧化酶（NOX）产生活性氧（ROS），进而依赖PAD4介导组蛋白瓜氨酸化（CitH3），最终驱动NETosis。抗氧化剂或NOX抑制剂可完全阻断该过程。
5. 5.
   G-CSF诱导的NET促进STIC模拟细胞与HGSC细胞的细胞间粘附与锚定非依赖性生长（AIG）
   通过共培养实验发现，FF预处理的NETotic中性粒细胞可显著增强FE25（STIC模拟细胞）和OVSAHO（HGSC细胞）的软琼脂集落形成能力，而使用PAD4抑制剂GSK484或DNase I处理则能逆转该效应。值得注意的是，NETotic中性粒细胞的条件培养基对AIG无影响，提示NET的物理结构而非可溶性因子主导了细胞聚集和转化表型。
6. 6.
   FF预处理的NETotic中性粒细胞通过旁分泌效应增强细胞粘附与侵袭能力
   NETotic中性粒细胞的条件培养基使FE25和OVSAHO的基质粘附能力分别提升578倍和80倍，Matrigel侵袭能力提高3–4倍。这一效应依赖于G-CSF和PAD4的活性，再次印证NETosis在促进癌细胞侵袭性中的关键作用。
7. 7.
   FF诱导的NETosis促进STIC模拟细胞与HGSC细胞的早期腹膜种植
   体内实验显示，与FF共注射可显著增强FE25和OVSAHO细胞在NSG小鼠腹腔中的定植信号（最高提升6.4倍），而联合PAD4抑制剂则能有效抑制这一促癌效应，明确NETosis在体内腹膜种植中的功能性贡献。

结论与讨论

本研究首次揭示生理性排卵可通过卵泡液中的G-CSF诱发腹膜中性粒细胞浸润及NETosis，从而构建一个支持癌细胞种植的促转移微环境。这一发现不仅将排卵这一周期性生理事件与HGSC的早期转移机制直接联系起来，还阐明了G-CSF/ROS/NOX/PAD4信号轴在其中的核心作用。值得注意的是，NETosis通过提供细胞外DNA支架促进癌细胞聚集和存活，并通过释放旁分泌因子增强侵袭能力，从而实现了从“良性微环境”向“促癌微环境”的转变。

该研究的临床意义尤为突出：对于携带BRCA突变或已发现STIC病变的高危人群，抑制NETosis或许能成为一种有效的早期干预策略。此外，研究结果也提示，传统针对癌细胞自身信号通路的治疗策略可能需要结合免疫微环境调控，尤其是中性粒细胞相关机制，才能更有效地遏制HGSC的腹膜转移。

尽管本研究聚焦于卵巢癌，但其机制可能适用于其他腹腔转移性肿瘤。未来工作需进一步探索NETosis在人体内的动态过程及其与其他免疫细胞的交互作用，以推动相关靶向治疗向临床转化。