泪液细胞外囊泡中磷酸化Tau 181蛋白的富集及其在阿尔茨海默病诊断中的意义

本刊推荐：为探索阿尔茨海默病（AD）的非侵入性诊断方法，研究人员开展泪液细胞外囊泡（EVs）生物标志物研究。发现EV结合型磷酸化tau 181（pTau-181）较游离态显著升高1.7倍（P=0.016），而Aβ亚型主要以游离形式存在（>88%）。认知障碍组EV总蛋白水平升高2.8倍，表明泪液EVs可作为AD诊断的新型生物样本来源。

　　

随着全球老龄化进程加速，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）已成为威胁老年人健康的重大神经退行性疾病。目前全球约有5500万痴呆患者，其中AD占比高达80%。该疾病的主要病理特征包括细胞外淀粉样蛋白β（amyloid-β, Aβ）斑块沉积和细胞内神经原纤维缠结，后者主要由过度磷酸化的tau蛋白构成。传统的AD诊断依赖于脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）检测或正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET），这些方法不仅具有侵入性，且成本高昂，限制了其临床应用。近年来，血液中磷酸化tau 217（pTau-217）的检测为AD诊断提供了微创替代方案，但寻找更加便捷、经济的诊断方法仍是研究人员追求的目标。

在此背景下，泪液作为一种完全非侵入性、易于获取且可重复采集的生物样本，逐渐受到关注。研究表明，泪液中的总tau蛋白水平在痴呆患者中显著高于主观认知下降患者，但Aβ肽段在诊断组间未显示显著差异。这种局限性促使研究人员将目光投向泪液中的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）——这些脂质包裹的纳米颗粒能够携带蛋白质、DNA和RNA等生物活性分子，在细胞间通信和疾病相关分子传递中发挥关键作用。尽管血液和CSF来源的EVs已在AD研究中取得进展，但泪液来源EVs在AD中的作用尚未被探索。

为了解决这一知识空白，荷兰马斯特里赫特大学医学中心的研究团队开展了一项创新性研究，成果发表在《Neurobiology of Disease》。研究人员假设泪液EVs可能富集AD相关生物标志物，特别是磷酸化tau蛋白，从而为AD诊断提供新的洞察。

本研究采用了多学科交叉的技术路线。研究人员从30名参与者（10名认知正常者和20名认知障碍者）中收集泪液样本，使用Schirmer试纸进行标准化采集。通过ExoQuick聚合物沉淀法分离EVs，并采用纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）对颗粒进行表征。使用放射性免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay, RIPA）缓冲液裂解EVs，通过 bicinchoninic acid（BCA）法量化总蛋白含量。关键生物标志物磷酸化tau 181（pTau-181）和Aβ亚型（Aβ38、Aβ40、Aβ42）的检测采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunoassay, ELISA）技术，分别测量EV结合型和游离型蛋白分数。统计分析采用Gamma-log广义线性模型，校正年龄和性别因素。

3.1. 参与者特征

研究纳入了30名来自TearAD研究的参与者，其中认知障碍组（包括轻度认知障碍和痴呆患者）年龄显著高于认知正常组（74±6岁 vs. 66±5岁，P=0.001），迷你精神状态检查（Mini-Mental State Examination, MMSE）评分也存在显著差异（25[4] vs. 30[1]，P<0.001）。

3.2. 总蛋白定量和EV特征

EV结合型总蛋白浓度显著高于游离型蛋白（P≤0.001）。特别值得注意的是，认知障碍组的EV总蛋白水平比认知正常组高2.8倍（216[150] vs. 78[101] fg/μg，P=0.019），而游离型蛋白水平在两组间无显著差异。NTA分析证实了分离的沉淀物中EV颗粒（30-150 nm）的富集。

3.3. pTau-181水平

pTau-181在所有的游离型和EV结合型样本中均100%可检测。EV结合型pTau-181水平显著高于游离型（1.7倍，38[46] vs. 23[22] fg/μg，P=0.016），其中71%的pTau-181以EV结合形式存在。两组间EV结合型pTau-181水平无显著差异（P=0.074）。

3.4. 淀粉样蛋白β水平

游离型Aβ肽段100%可检测，EV结合型Aβ也显示高检测率（Aβ38为97%，Aβ40为93%，Aβ42为100%）。所有三种Aβ亚型的游离型水平均显著高于EV结合型（P<0.001）：Aβ38高29倍，Aβ40高13倍，Aβ42高10倍。超过88%的Aβ以游离形式存在。认知障碍组的游离型Aβ40和Aβ42水平显著高于认知正常组（P=0.021和P=0.012）。

3.5. AD生物标志物水平与MMSE评分的相关性

EV结合型Aβ38、Aβ40和Aβ42均与MMSE评分呈中度正相关（P=0.019、0.039和0.016），而pTau-181（无论是EV结合型还是游离型）与MMSE评分无显著相关性。

本研究首次证实了泪液来源EVs中AD生物标志物的存在，并揭示了pTau-181和Aβ蛋白在泪液中的不同分布模式。研究发现pTau-181主要存在于EVs中（71%），而Aβ肽段主要以游离形式存在（>88%），这表明这两种蛋白在泪液中可能通过不同的机制分泌和运输。

EV结合型pTau-181水平显著高于游离型，这与先前关于EVs是磷酸化tau主要运输途径的研究一致。尽管本研究未发现认知障碍组和正常组间pTau-181水平的显著差异，但EVs中pTau-181的富集表明分离EVs可能提高AD生物标志物检测的敏感性。相比之下，Aβ肽段主要作为游离蛋白存在，支持了Aβ可能通过其他机制（如隧道纳米管或直接外泌）进行细胞间传输的理论。

值得注意的是，认知障碍组的EV总蛋白水平显著升高（2.8倍），这可能反映了疾病状态下EV分泌的增加。此外，EV结合型Aβ水平与MMSE评分的正相关关系表明，较高的EV Aβ水平可能与较好的认知功能相关，这一发现与某些血浆EV研究结果一致。

本研究在方法学上取得了重要进展，实现了pTau-181的100%检测率，相比之前研究中pTau-231低于23%的检测率有显著提高。这得益于检测方法的优化和pTau-181异构体的选择，因为先前研究表明pTau-181在泪液中的含量高于pTau-231。

研究的局限性包括样本量较小、缺乏Aβ-PET或CSF Aβ状态确认，以及EV分离方法的标准化问题。不同的EV分离方法（超速离心、尺寸排阻色谱法和聚合物沉淀法）可能影响结果的可比性，突显了建立标准化泪液EV分离协议的迫切性。

总之，这项研究为AD的非侵入性诊断开辟了新途径。泪液EVs作为生物标志物来源具有独特优势：完全非侵入性、易于重复采集、成本相对较低。研究发现泪液EVs中pTau-181的富集现象特别令人鼓舞，表明EV分离可能提高AD生物标志物检测的敏感性。未来研究需要在更大规模队列中验证这些发现，并整合Aβ-PET或CSF生物标志物数据以确认AD病理。此外，检测其他神经生物标志物如神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）、突触体相关蛋白25（synaptosomal-associated protein 25, SNAP25）和TAR DNA结合蛋白43（TAR DNA-binding protein 43, TDP-43）将有助于进一步优化AD的诊断和分层。多中心合作和标准化操作程序的建立将推动泪液生物标志物研究向临床转化迈进，最终为AD的早期诊断和干预提供有力工具。