酿酒酵母麦角固醇生物合成途径重构及其在柑橘皮加工工业中的可持续应用

本研究针对柑橘加工副产物资源化利用难题，通过合成生物学策略重构酿酒酵母麦角固醇（Ergosterol）生物合成途径。研究人员强化MVA（甲羟戊酸）途径、角鲨烯后修饰及麦角固醇合成模块，使工程菌株麦角固醇产量提升19.15倍（达23.38 mg/g DCW），并首次发现高麦角固醇含量可增强菌株对柑橘副产物中D-柠檬烯（D-limonene）胁迫的抗性。该菌株能以柑橘皮水解液为底物发酵产乙醇（摇瓶2.35 g/L，5-L反应器5.65 g/L），为柑橘加工废弃物高值化利用提供绿色新途径。

　　

在全球柑橘加工产业中，每年产生数百万吨柑橘皮废弃物，这些富含纤维素、果胶等成分的副产物若处理不当，将造成严重的环境污染。更棘手的是，柑橘皮中富含的D-柠檬烯（D-limonene）对微生物具有强烈毒性，严重制约了微生物发酵法转化柑橘废弃物的效率。与此同时，麦角固醇（Ergosterol）作为真菌细胞膜的关键组成成分，不仅是维生素D₂的前体物质，更在维持线粒体DNA稳定性、增强细胞抗逆性方面发挥着至关重要的作用。能否通过提升酵母菌的麦角固醇含量来增强其对D-柠檬烯的耐受性，从而实现柑橘废弃物的高效生物转化，成为研究者关注的核心问题。

针对这一挑战，发表于《New Biotechnology》的研究团队开展了一项系统性合成生物学研究。研究人员以模式真核微生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为底盘细胞，通过多模块代谢工程策略对其麦角固醇生物合成途径进行全方位重构。研究主要采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对工业酵母菌株进行多位点基因整合，通过高效液相色谱（HPLC）进行代谢产物定量分析，并结合细胞染色法（甲基蓝染色）评估细胞活力。所有实验均使用柑橘皮水解液作为发酵底物，该底料通过酶法（纤维素酶和木聚糖酶）从干燥柑橘皮粉中制备。

研究结果首先证实了甲羟戊酸途径（MVA pathway）的关键限速步骤的改造效果。通过过表达异戊烯二磷酸异构酶（IDI1）和截短型HMG-CoA还原酶（tHMG1）基因，工程菌株GL-MVA02的麦角固醇产量达到1.61 mg/g DCW，为后续改造奠定基础。

在角鲨烯后修饰途径（post-squalene pathway）模块中，研究人员创新性地采用了细胞器工程策略。将ERG9基因与线粒体定位信号（MLS）融合，使角鲨烯合成酶定位于线粒体；同时将ERG1、ERG7、ERG11、ERG24和ERG25等基因与内质网定位标签（ERs）融合，实现酶的空间定向分布。这种亚细胞区室化策略使工程菌株GL-PS06的麦角固醇产量提升至2.77 mg/g DCW。

在麦角固醇生物合成模块，研究人员进一步过表达了ERG2、ERG3、ERG6、ERG4和ERG5等系列基因，最终获得的GL-EP03菌株产量达到6.01 mg/g DCW，较原始菌株提高4.18倍。

最令人瞩目的发现来自转录因子调控模块。通过敲除转录抑制因子ROX1基因，解除了对麦角固醇合成基因的抑制，使产量跃升至11.95 mg/g DCW。随后过表达乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）和固醇调控元件结合蛋白（ECM22），最终获得的GL-RF07菌株麦角固醇产量达到23.38 mg/g DCW，创下19.15倍的惊人提升。

抗性实验结果表明，高麦角固醇含量显著增强了酵母对D-柠檬烯的耐受性。经0.2% D-柠檬烯处理20小时后，工程菌株GL-RF07的细胞存活率达到90.85±3.38%，显著高于原始菌株的78.05±2.78%。甲基蓝染色和菌落形成实验共同证实了工程菌株优异的胁迫抗性。

应用性能评估显示，工程菌株GL-RF07在柑橘皮水解液发酵中表现出色：摇瓶发酵24小时乙醇产量达2.35 g/L，5-L生物反应器中更是达到5.65 g/L，柑橘皮粉到乙醇的转化率约为3.3%。

研究结论表明，通过系统性代谢工程策略成功重构了酿酒酵母的麦角固醇生物合成途径，不仅实现了产量的显著提升，更重要的是发现了麦角固醇含量与D-柠檬烯抗性之间的正相关关系。这项研究首次报道了通过工程化麦角固醇生物合成来增强酵母对柑橘加工副产物中毒性物质的耐受性，为柑橘废弃物的资源化利用提供了创新性解决方案。该策略不仅拓展了合成生物学在工业生物技术中的应用边界，也为开发可持续、环境友好的生物能源生产方式提供了重要借鉴，具有显著的工业应用价值和环境保护意义。