利用海洋硅藻三角褐指藻叶绿体异源合成β-蒎烯的代谢工程研究

本研究针对β-蒎烯传统生产依赖植物提取、效率低且纯度不足的问题，通过在海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum中叶绿体定位表达异源蒎烯合酶（PinS），首次实现了利用MEP途径高效合成β-蒎烯（最高达20.07 ± 0.51 μg·L-1），为微生物光合生产高值单萜类化合物提供了新策略。

　　

萜类化合物是一类广泛存在于自然界的重要次生代谢产物，在食品、化妆品和医药等领域具有广泛应用。其中，单萜类化合物β-蒎烯（β-pinene）因其独特的化学性质和商业价值（年市场规模约1.02亿美元）备受关注。它不仅被用于香料和树脂工业，还作为食品添加剂、高密度航空燃料替代品和生物材料的前体，近年来更因其抗菌、抗炎等药用价值显示出巨大的医药潜力。然而，目前β-蒎烯的生产主要依赖从松节油中分馏提取，这种方法受植物种类、采收时间和地理来源的影响较大，导致产量不稳定、纯度低，且生产过程不可持续。

为了解决这一问题，研究人员将目光投向了微生物合成。尽管大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等模式微生物已被用于萜类化合物的异源生产，但它们通常需要复杂的代谢工程改造来引入或增强萜类前体的合成途径。相比之下，海洋硅藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）因其生长快速、耐受性强、天然富含萜类化合物（如岩藻黄素），且同时拥有胞质甲羟戊酸（MVA）途径和叶绿体甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径两条萜类前体合成通路，成为一种极具潜力的光合微生物底盘。然而，此前关于P. tricornutum中单萜类化合物的研究多集中于胞质MVA途径，叶绿体MEP途径的潜力尚未被充分探索。

发表在《New Biotechnology》的这项研究，首次在P. tricornutum中系统比较了胞质和叶绿体定位表达异源蒎烯合酶（Pinene synthase, PinS）对β-蒎烯合成的影响，并探索了不同基因表达策略（附加体表达与染色体随机整合）对产量的提升效果。

研究主要采用了以下关键技术方法：1）基因构建与优化：选择来自Abies grandis（AgPinS）和Citrus limon（ClPinS）的PinS基因，去除其植物来源的叶绿体转运肽（CTP），并融合P. tricornutum来源的AtpC CTP以实现叶绿体靶向；2）遗传转化：通过细菌接合转化实现附加体表达（EE），通过电转线性DNA片段实现染色体随机整合表达（RICE）；3）亚细胞定位验证：利用共聚焦显微镜观察mNeonGreen荧光蛋白标记的PinS定位；4）产物分析与定量：采用双相培养系统（覆盖1%肉豆蔻酸异丙酯）进行原位萃取，并通过GC-MS定量分析蒎烯产量；5）酶活检测：使用细胞粗提液体外添加底物GPP验证PinS活性。

研究结果如下：

生成转基因品系及异源AgPinS酶的亚细胞定位

研究人员成功构建了可在胞质或叶绿体中表达AgPinS的转基因藻株。共聚焦显微镜观察证实，融合AtpC CTP的PinS定位于叶绿体，而未融合的则保留在胞质中。

叶绿体定位决定P. tricornutum转基因品系中的β-蒎烯合成

体内生产实验显示，只有叶绿体定位表达的品系（EE_CTP_AgPinS）能检测到β-蒎烯（最高3.27 ± 0.64 μg·L^-1），而胞质表达的品系（EE_AgPinS）则未检测到产物，表明叶绿体MEP途径是更有效的萜类前体来源。

蒎烯合酶无论亚细胞定位如何均能表达且具有功能

体外酶活实验发现，所有表达AgPinS的品系（包括胞质定位）的粗提液在添加底物GPP后均能合成β-蒎烯，证明胞质中的酶同样具有功能，其体内无法检测到产物可能是由于胞质中前体GPP的可用性不足。

基因组整合相较于染色体外表达可增强β-蒎烯生产

通过RICE策略获得的转基因品系表现出更高的β-蒎烯产量。表达AgPinS的品系（RICE_CTP_AgPinS 10）产量达19.35 ± 1.42 μg·L^-1，而表达ClPinS的品系（RICE_CTP_ClPinS 6）产量达20.07 ± 0.51 μg·L^-1，约为附加体表达品系的3倍。所有品系均副产α-蒎烯，约占总单萜产量的20-25%。

在讨论部分，作者指出叶绿体因其富含MEP途径底物、还原力强以及天然存在GPP合成酶，是单萜合成的理想场所。本研究首次在P. tricornutum中证实了叶绿体MEP途径用于异源β-蒎烯合成的优越性。尽管目前产量尚未达到商业化水平，但该研究为利用光合微生物可持续生产高值萜类化合物奠定了基础。未来通过代谢工程（如过表达MEP途径限速酶、引入特异性GPPS、优化产物回收方法）及蛋白质工程（改造PinS以提高催化效率和β-蒎烯特异性）等手段，有望进一步提升产量和经济可行性。

综上所述，该研究不仅拓展了海洋硅藻在绿色生物制造中的应用前景，也为开发高效、可持续的微生物细胞工厂提供了重要理论和实践依据。