综述：植物线粒体研究新进展：细胞质雄性不育的应用革命

本综述系统探讨了植物线粒体研究的最新突破，重点聚焦细胞质雄性不育（CMS）在杂交育种中的革命性应用。文章详细解析了线粒体基因组（mtDNA）的复杂结构、转录组特性及蛋白组功能，并综述了mitoTALENs、mitoCRISPR-Cas等基因编辑技术对CMS相关基因的靶向修饰进展。同时，作者还总结了高纯度线粒体分离技术（如亲和纯化法）对揭示CMS分子机制的关键作用，为创制新型不育系和恢复系提供了理论和技术支撑。

　　

植物线粒体的一般特征

植物线粒体作为半自主性细胞器，起源于α-变形菌的内共生事件，其基因组（mtDNA）编码电子传递链（ETC）关键蛋白及自身翻译机制元件。与动物相比，植物mtDNA尺寸显著增大（200–700 kb），主要归因于高重复序列、AT富集非编码区及大内含子的存在。高通量测序技术（如长读长测序）已推动600余个物种的线粒体基因组完成解析，揭示其多态性结构包括环状分子、线性单元及分支染色体等。线粒体数量因细胞类型而异（100–10,000个/细胞），通过肌动蛋白丝快速移动并频繁发生融合/分裂事件，导致核糖核蛋白颗粒分布不均。这种动态特性与多拷贝特征为遗传转化带来挑战，而亚化学计量偏移现象在育性决定中起关键作用。

基因组

植物mtDNA的高度重组活性源于重复序列间的同源重组，不仅形成嵌合基因（如CMS相关基因），还导致种内甚至种间广泛变异。其转录本几乎覆盖全基因组，但仅小部分为蛋白编码序列（约60–80个保守基因），其余为非编码RNA，可能参与前向与逆行信号调控。线粒体基因转录起始点多样，产生多种成熟RNA异构体，需经过内切/外切核酸酶加工及II型内含子自剪接（依赖RNA成熟酶、解旋酶及PPR蛋白）方能成熟。值得注意的是，陆地植物线粒体存在RNA编辑事件（如C-to-U），可改变密码子类型或蛋白质结构，其中PLS型PPR蛋白（含DYW结构域）是编辑体的核心组分。

转录组

植物线粒体蛋白组包含2,000–3,000种蛋白质，除线粒体自身编码的ETC复合物和核糖体蛋白外，多数由核基因编码后通过靶向信号（MTS）导入。核编码的PPR蛋白家族（超过400个成员）在线粒体RNA加工中发挥核心作用，包括转录调控、翻译激活及RNA编辑。线粒体作为细胞能量工厂，通过三羧酸循环（TCA）和氧化磷酸化（OXPHOS）系统产生ATP，其独特之处在于拥有替代氧化酶（AOX）、苹果酸氧化途径及抗氰呼吸能力。此外，线粒体是活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的主要来源，通过锰超氧化物歧化酶、抗坏血酸-谷胱甘肽循环等抗氧化系统维持稳态。CMS相关嵌合基因常与ETC基因（如cox1、atp6）共转录，破坏ROS平衡并导致花药发育中细胞死亡。

蛋白组

植物线粒体基因工程进展

自然存在的CMS系统在作物育种中广泛应用，但存在环境敏感性或恢复基因缺乏等局限。通过人工修饰线粒体DNA、RNA或蛋白质创建新型CMS表型已成为可能。尽管质体转化已在20余种开花植物中实现，线粒体直接转化仍因缺乏选择标记和大分子递送方法而进展缓慢。近年来，序列特异性核酸酶（如TALENs、CRISPR-Cas系统）的应用推动了间接基因编辑技术的发展。

MitoCRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas9系统应用于线粒体时面临gRNA和Cas蛋白导入难题。通过优化密码子偏好性及利用PNPase介导的gRNA转运（如添加RP-loop结构），mito-Cas12a系统在线粒体DNA靶向切割中展现潜力。烟草中针对mtATP9的编辑实验成功降低基因拷贝数并诱导CMS表型，但多拷贝特性可能导致重组修复与状态不稳定。

MitoTALEN系统

MitoTALENs通过融合MTS与TALE阵列，可实现线粒体基因特异性敲除。该技术已成功应用于水稻WA352、萝卜orf138及拟南芥ATP6等基因，恢复或创建CMS表型。紧凑型cMitoTALENs与TALEN-GDM（基因驱动诱变）策略进一步提升了同质突变率和遗传稳定性。尽管载体构建复杂且成本较高，mitoTALENs在实现精准缺失与低脱靶率方面仍是当前最有效的线粒体编辑工具。

DddA衍生系统

基于细菌毒素DddA的胞嘧啶脱氨酶特性，DdCBEs和TALEDs系统可实现线粒体DNA的C-to-T及A-to-G碱基编辑。生菜和油菜中atp6基因编辑效率达25%，而TALEDs在人线粒体中编辑频率高达49%。新型CyDENT和mitoBEs系统通过切口酶与单链DNA脱氨酶结合，提升了编辑精度与链特异性，为植物线粒体精准调控提供新途径。

RNA编辑

PPR蛋白可通过识别特定RNA碱基（依赖第5/35位氨基酸残基）实现靶向RNA切割或编辑。合成PPR蛋白（如RFL RPF2变体）可定向沉默nad6、atp1等基因，模拟CMS恢复机制。PLS型PPR蛋白（如dsn3PLS-DYW、TRX-9SDYW）可实现C-to-U编辑，效率达40–50%，而KP变异型甚至可实现U-to-C反向编辑。这类RNA水平编辑无需DSB，为CMS机制研究和育种应用开辟新方向。

植物线粒体分离技术进展

植物线粒体尺寸微小（1–3 μm），需借助电子显微镜（如冷冻电镜cryo-EM）观察超微结构及蛋白复合物解析。高质量线粒体分离对功能研究至关重要。

传统方法

差速离心（2,000 × g和20,000 × g）可获粗提线粒体，但混杂质体、过氧化物酶体等污染物。通过蔗糖/ Percoll密度梯度超离心（70,000 × g）可提高纯度，满足mtDNA测序或蛋白质组分析需求。"二合一"法采用甘露醇与蔗糖分层梯度，形成线性纯化带，但样本需求量大（100 g材料）且耗时长（>1小时）。

亲和纯化方法

亲和纯化（AP）技术通过标记OMM蛋白（如TOM5、TOM22）实现线粒体快速免疫捕获，仅需1 g组织即可在25分钟内获取100 μg线粒体蛋白。IMTACT技术利用细胞特异性启动子（如CAB3、SUC2）标记OM64，实现特定细胞类型线粒体分离，为花药早期发育研究提供可能。但该方法依赖转基因材料构建，且非特异性污染需严格控制。

质量控控

线粒体制备质量需从完整性（膜电位检测、细胞色素c通透性）、纯度（标志酶活性如MDH、CAT）及功能性（CCO酶活）多维度评估。质谱技术（MS）可直接检测污染物，确保实验可靠性。

比较分析

纯化线粒体支持比较基因组学（如CMS相关orf288、FA182鉴定）、转录组学（RNA编辑/剪切分析）及蛋白质组学研究。尽管已有大量CMS与可育系比较研究，直接利用纯化线粒体的分析仍较少。高效亲和纯化技术有望突破这一瓶颈。

结论与展望

CMS依赖型杂交育种显著提升作物产量并保障粮食安全。未来研究需聚焦以下方向：解析植物mtDNA复杂基因组结构；探索非编码转录本功能；建立线粒体蛋白质组数据库；发展高效遗传操作技术；完善线粒体快速分离方法。这些突破将深化CMS/Rf系统认知，推动具有农业经济价值的新种质创制。