法国比利牛斯山雪居黏菌的生物多样性研究：双分子标记（nucSSU与EF1A）揭示隐秘物种与系统发育关系

本研究针对雪居黏菌物种鉴定困难及隐秘多样性未知的问题，在法国比利牛斯山开展大规模系统调查，结合形态学与分子标记（nucSSU与EF1A）技术，成功对738份样本进行条形码测序与系统发育分析。结果显示该地区存在较高比例的隐秘物种（形态型与核糖体型比例达1:2.9），并验证了nucSSU条形码策略的可靠性。研究为雪居黏菌多样性评估、物种界定及高山生态系统保护提供了高质量的数据集与方法学支撑。

　　

在高山生态系统中，有一类特殊的生物群体——雪居黏菌（nivicolous myxomycetes），它们属于黏菌门（Amoebozoa, Myxomycetes），通常在春季雪线附近完成其生活史并形成子实体。这类生物虽然种类不多（约占已知黏菌物种的9%），但由于其形态可塑性高、生境特殊且鉴定困难，一直是真菌学和生态多样性研究中的难点。尤其在气候变化背景下，高山生态系统的脆弱性日益凸显，准确评估这类特殊生物的多样性及其分布格局，对理解生物适应机制和生态系统功能具有重要意义。

以往的研究多依赖于形态学鉴定，但由于许多物种形态相似、标本易受损或发育不全，仅凭形态特征难以准确区分物种，更无法识别出那些形态相似但遗传差异显著的“隐秘物种”。近年来，DNA条形码技术的应用为物种鉴定提供了新思路，其中核糖体小亚基基因（nuclear small subunit ribosomal gene, nucSSU）被广泛应用于黏菌的系统分类。然而，单凭一个基因是否足以区分近缘物种？其结果是否可靠？这些问题仍待验证。

在此背景下，由德国格赖夫斯瓦尔德大学（University Greifswald）Martin Schnittler教授带领的研究团队，选择法国比利牛斯山（Hautes-Pyrénées）作为研究区域，于2022年4月30日至5月6日开展了一项系统性的野外调查与分子系统学研究。该研究不仅采集了738份标本，还成功对其中绝大多数样本进行了nucSSU（成功率88.3%）和翻译延伸因子1-α基因（elongation factor 1-alpha, EF1A，成功率67.2%）的扩增与测序，旨在通过双分子标记互证，评估该地区雪居黏菌的多样性、检验条形码技术的可靠性，并探索是否存在未被描述的隐秘物种。

研究人员采用形态学观察与分子系统学分析相结合的方法。野外采样使用地理信息系统辅助记录，每个样本均经立体显微镜和光学显微镜鉴定，并制备永久玻片。DNA提取采用“Quick n’ Cheap”流程，分别使用特异性引物S2/SU19R（nucSSU）和PB1F/PB1R（EF1A）进行PCR扩增与测序。序列经比对后，采用最大似然法构建系统发育树，使用IQ-Tree和iTOL进行可视化和分析。此外，研究还应用了物种累积曲线（SAC）、香农多样性指数（Shannon's H′）以及单倍型网络分析（使用LineChart软件）以评估多样性和遗传重组情况。

3.1 形态与分子多样性

共采集738份标本，其中718份可进行形态学鉴定，共识别出32个分类单元（包括31个暗孢类和1个亮孢类Trichia alpina）。nucSSU序列分析共得到90个核糖体型（ribotype, RT），EF1A得到126个基因型（genotype, GT），远高于形态类型数量（MT），形态型与核糖体型比例达1:2.9，表明存在大量隐秘多样性。常见种如Lamproderma ovoideum平均每个群落包含679个子实体，而稀有种如Lamproderma argenteobrunneum则多为单株出现。

3.2 分子标记对物种分化的支持

nucSSU与EF1A系统发育树高度一致，所有形态物种在分子水平均能得到区分，但并非所有种均为单系群。例如Polyschismium fallax与P. peyerimhoffii虽形态不同却聚为一支，但条形码序列存在4个碱基差异；EF1A进一步提高了这对物种的分辨率。此外，在P. chailletii中识别出两个明显分歧的进化支（群A和群C），暗示其为隐秘物种复合体。EF1A在Meriderma属中显示出比nucSSU更高的分辨率，支持其当前的形态种划分。

3.3 分类学注释

基于分子结果，研究重点描述了Didymium dubium与D. pseudodecipiens的形态差异：后者具鳞片状石灰质、孢囊较大（12–15 μm）、孢丝较粗（1–2.5 μm），而前者为粉末状石灰质、孢子较小（10.5–12.5 μm）。同样，对P. chailletii群A和群C也进行了显微形态对比，群C具浅色柔韧孢丝与均匀褐色孢子，群A则孢丝深色粗壮、孢子具浅色区域。

3.4 比利牛斯山雪居黏菌数据汇总

本研究新增该地区2个物种记录（Enerthenema intermedium和Lamproderma pulchellum），使整个比利牛斯山脉已记录的雪居黏菌达55种，占全球已知种类的一半。研究还发现，子实体发生高峰期位于海拔1600–1800米，与局部气候和融雪时间密切相关。

本研究通过大规模采样与双基因标记分析，证实了nucSSU作为黏菌条形码的可靠性，并得到EF1A的独立验证。结果显示雪居黏菌中存在较高的隐秘多样性，形态物种与分子进化支之间存在显著不一致，尤其在Meriderma、Didymium和Polyschismium等属中。这些发现对传统分类系统提出挑战，也凸显了整合形态、生态与分子数据在物种界定中的必要性。

研究的另一重要贡献在于建立了首个来自比利牛斯山的、经条形码验证的雪居黏菌数据集，为后续比较生态学、生物地理学及气候变化响应研究提供了基础。此外，研究中发现的一些稀有种类（如Lamproderma cacographicum）仅出现于小群落中，说明系统采样对全面评估多样性至关重要。

尽管EF1A在分辨率上表现优异，但其扩增成功率较低，尤其在Physarum vernum、Didymium dubium等物种中，提示其作为通用条形码的局限性。因此，nucSSU仍更适用于大规模多样性筛查。

综上所述，该研究不仅推进了我们对高山黏菌多样性的认知，也为未来描述新物种、修订分类系统提供了分子与形态依据。作者建议在新种描述中应尽量提供分子序列数据，以促进该类群研究的标准化与可比较性。这一方法论框架也有望推广至其他复杂微生物类群的研究中。