m7G-PIP技术实现活细胞RNA-蛋白质互作组的纳米级原位解析及其在HSV-1感染机制研究中的应用

本文开发了一种名为m7G-PIP（m7G邻近互作组分析）的无抗体技术，通过邻近标记（PL）实现活细胞内m7G修饰位点周围RNA-蛋白质互作网络的原位纳米级（<20 nm）绘图，解决了传统方法（如MeRIP-seq/miCLIP-seq）需细胞裂解且无法动态观测的局限。该技术成功应用于疱疹 simplex 病毒1型（HSV-1）感染研究，首次发现病毒转录本内部m7G修饰，并揭示其通过稳定甲基转移酶METTL1-WDR4复合物促进病毒mRNA核输出的新机制，为靶向RNA修饰的抗病毒药物开发提供了新策略。

　　

Section snippets

Plasmids construction

为构建m⁷G特异性靶向传感器，将QKI蛋白的QUA1-KH-QUA2结构域与相邻的APEX2酶片段通过GGGGS连接子串联，并插入pcDNA3.1(+)载体的EcoRⅠ和HindⅢ限制性位点之间。载体末端添加FLAG标签，随后将SV40 NLS片段无缝克隆至载体中，构建QKI-APEX2-FLAG-1×NLS和QKI-APEX2-FLAG-2×NLS质粒。METTL1载体则通过……

Development of m⁷G-PIP technology

设计的m⁷G特异性传感器整合三大功能模块：（i）m⁷G识别模块——源自Reader蛋白QKI的QUA1-KH-QUA2结构域，特异性结合mRNA内部m⁷G位点；（ii）邻近标记模块——采用工程化抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2）催化空间限制性生物素化反应；（iii）追踪定位模块——整合FLAG标签实现实时亚细胞分辨率（图1a，附录A）。

Conclusions

本研究开发的m⁷G-PIP技术首次实现了活细胞内m⁷G修饰位点周围互作组的纳米级原位绘图。应用该技术于HSV-1病毒，不仅鉴定了病毒转录本内部的m⁷G修饰位点，更揭示病毒通过激活去泛素化酶Usp9x稳定宿主甲基转移酶METTL1，进而促进病毒mRNA核出口的新机制。