一种具有分层微/纳米结构的涂层，该涂层在钛植入物上负载了ZIF-8@RIS纳米颗粒，能够在温和温度下实现近红外响应的抗菌效果

《Surface and Coatings Technology》：A hierarchical micro/nanostructural coating loaded ZIF-8@RIS on Ti implants for NIR responsive antibacterial at mild temperature

钛基植入物表面通过两步碱热处理法构建了ZIF-8负载RIS的复合涂层，兼具光热抗菌和骨整合功能。研究表明，该涂层在50℃下即可通过近红外光热效应协同Zn2?释放实现高效抗菌，同时促进成骨细胞增殖分化，动物实验证实其无组织损伤且抑制率高达96%。

　　钛基生物医用植入物在临床应用中常常面临诸如无菌松动和细菌感染等并发症，这些问题会显著降低植入手术的成功率。为了应对这些挑战，研究人员开发了一种复合涂层，该涂层由ZIF-8组成，ZIF-8是通过锌离子（Zn2?）与2-甲基咪唑的配位反应形成的，并且负载了羟乙二膦酸钠（RIS）。这种涂层通过一种两步碱性水热法应用于纯钛表面，同时赋予其抗菌性能和促进成骨分化的能力。实验结果显示，HT/ZIF-8@RIS涂层表现出优异的光热抗菌性能，能够在约50℃的温和温度下有效抑制细菌生物膜的形成。体外和体内实验进一步表明，该涂层具有良好的生物相容性，并且可以显著促进成骨细胞的增殖和分化，显示出在促进骨整合方面的潜力。动物实验确认了HT/ZIF-8@RIS涂层在体内具有优越的光热抗菌性能，同时不会对周围组织造成损伤。这些发现为改善钛基植入物在临床环境中的抗菌效果和性能提供了一种有效且有前景的策略。

钛（Ti）及其合金因其低密度（约4.5 g/cm3）、高比强度以及弹性模量接近人类皮质骨（约110 GPa）而在骨科和牙科植入领域成为修复骨缺损的标准材料。然而，钛的固有缺点限制了其在临床中的应用。钛表面自然形成的氧化钛（TiO?）被动膜厚度为2-10纳米，缺乏生物活性和抗菌性能，这不仅难以促进骨整合，还容易引发假体周围感染。此外，钛表面表现出强疏水性（接触角>80°），这会阻碍蛋白质吸附和细胞相互作用，并且无法提供成骨所需的离子和生物活性分子。因此，通过表面改性赋予钛植入物抗菌和促进骨整合的功能，对于改善临床结果至关重要。

通过生物活性二氧化钛涂层可以改变钛基植入物的表面形貌和化学稳定性，从而诱导骨状磷酸盐的成核和沉积，这表明了其在促进成骨方面的潜力。最近的研究表明，经过碱性溶液水热处理的微-纳米多孔活化二氧化钛涂层可以增强其光吸收能力，改善光热转换性能，从而提供光热抗菌特性。特别是，通过调整纳米结构，如单个单元的尺寸、阵列高度和单元之间的间距，可以影响其光热性能。因此，制造具有特定纳米结构的生物活性二氧化钛涂层成为增强钛植入物光热抗菌性能的一个重要研究方向。

然而，为了实现有效的灭菌，光热治疗所需的温度通常超过55℃，这可能会超出人体组织的耐受范围。因此，单独使用高温光热处理进行抗菌活动存在一定的限制，因为这会引发对生物安全性的担忧。不过，细胞周围环境温度的适度升高仍然可以促进细胞膜的通透性，使分子和离子进入细胞，从而增强生理功能。因此，一种结合低温光热治疗和抗菌剂可控释放的新抗菌策略被提出。这种策略可以在不损害周围组织的情况下实现良好的抗菌效果。

锌在我们的生命活动中扮演着不可或缺的角色，一方面，它是一种重要的生命代谢中的微量元素，也是多种生物酶的重要辅因子。另一方面，锌离子（Zn2?）在抗菌方面也发挥着关键作用，因为它可能通过氧化应激和静电吸附破坏细菌细胞壁，导致细胞质流失、抑制细菌繁殖并最终导致细菌死亡。ZIF-8是一种多孔晶体聚合物，属于金属有机框架（MOF）的一种，它通过Zn2?与2-甲基咪唑的配位反应形成，具有高负载能力和良好的生物相容性。由于其在生理环境中的降解特性，ZIF-8可以通过释放Zn2?来表现出抗菌活性。此外，ZIF-8还被认为是一种理想的药物递送系统载体，因其多孔和可降解的特性。事实上，其结构允许在降解过程中有效负载药物，并将其控制释放到人体组织中。

羟乙二膦酸钠（RIS）是双膦酸盐（BPS）家族的一员，它对骨矿物质表现出强烈的亲和力，这归因于其两个紧密相连的磷酸基团，能够特异性地结合到骨骼组织中的羟基磷灰石，从而提高骨靶向性和摄取能力。此外，RIS还有促进成骨细胞（OBs）增殖和分化的优点，从而加速骨骼的发育和再生。因此，RIS已成为治疗骨科疾病的常用药物。基于此，ZIF-8的多孔结构可以用于在钛植入物表面负载RIS，以增强其生物活性。

在本研究中，研究人员首次在钛基底上开发了一种结合ZIF-8/RIS的二氧化钛涂层，用于低温光热抗菌应用。二氧化钛的多层网格结构首先通过水热处理形成，这增强了近红外（NIR）光的捕获能力，从而有助于光热抗菌效果。随后，ZIF-8@RIS被合成并固定在预形成的二氧化钛层上，进一步增强了基底的抗菌性能和成骨潜力。

研究材料包括锌硝酸盐六水合物、2-甲基咪唑、琼脂、氢氟酸、硝酸、氢氧化钠、羟乙二膦酸钠、胰蛋白胨大豆肉汤培养基、磷酸盐缓冲液、青霉素-链霉素溶液、胎牛血清、DMEM和α-MEM培养基、无水乙醇以及原始钛板。所有试剂均未经过进一步纯化即可使用。

在样品制备过程中，首先将用于实验的生物医用钛圆盘（尺寸为10 mm × 10 mm × 2 mm）依次在无水乙醇和去离子水中超声清洗。然后，制备一种包含浓硝酸和氢氟酸的化学抛光溶液（体积比为1:4:5），钛圆盘在该溶液中反应5分钟，之后放置在含有5M氢氧化钠溶液的反应罐中。接着，样品在120℃的烘箱中处理6小时。之后，样品用去离子水清洗并标记为HT。接下来，将Zn(NO?)?·6H?O（0.169 g/mL）和2-MeIM（0.328 mg/mL）混合，并在120℃下水热处理4小时，使用不同浓度的RIS溶液（0或10 mg/mL）。反应后，样品在80℃的烘箱中干燥过夜，最终收集干燥后的样品并分别标记为HT-Z和HT-Z/R，以表示ZIF-8或ZIF-8@RIS在HT样品表面的固定。

为了分析制备后的涂层结构和化学组成，研究人员采用了X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）等手段。XRD光谱显示，HT、HT-Z和HT-Z/R样品的涂层中出现了钛基底和钠钛酸盐的特征衍射峰，表明这些样品的表面形成了活性钛酸盐涂层。然而，在HT-Z和HT-Z/R样品中，没有观察到ZIF-8和RIS的明显特征衍射峰，这可能是由于ZIF-8/ZIF-8@RIS的负载量较低或结晶度不足。FTIR光谱显示，HT-Z和HT-Z/R样品中出现了C-N的伸缩振动峰，这些振动峰是由ZIF-8中咪唑环的弯曲振动引起的。在HT-Z/R样品中，出现了P-O键的伸缩振动峰，表明样品涂层中存在磷酸基团。XPS光谱显示，HT-Z和HT-Z/R样品中出现了N 1s和Zn 2p的特征峰，而HT-Z/R样品中还出现了P 2p的峰，这些结果初步证明了ZIF-8和ZIF-8@RIS成功地固定在HT样品表面。

为了评估样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能，研究人员采用了涂板法。结果显示，在黑暗中培养6小时后，HT样品表面附着的细菌数量比纯钛组更多。由于ZIF-8本身的抗菌性能，HT-Z和HT-Z/R样品表面的菌落数量有所减少。在NIR照射下，HT-Z和HT-Z/R样品对这两种细菌的抗菌效率分别达到了95.6%和94.5%以及96.3%和94.9%。这些结果表明，NIR照射显著增强了样品的抗菌效果。

为了进一步研究抗菌机制，研究人员还进行了ONPG和细菌蛋白泄漏测试。结果显示，与纯钛组相比，HT、HT-Z和HT-Z/R组在NIR照射前后均表现出更高的β-半乳糖苷酶活性，表明其能够提高细菌细胞膜的通透性。特别是，在NIR照射后，所有组的β-半乳糖苷酶活性均显著升高，尤其是HT-Z和HT-Z/R组，这表明它们在抗菌方面表现出更好的效果。同时，HT-Z和HT-Z/R样品表面残留的细菌蛋白含量最低，进一步证明了其出色的抗菌性能。

为了更深入地研究HT-Z/R样品对细菌的影响，研究人员使用FESEM观察了细菌在样品表面的形态特征和结构完整性。结果显示，纯钛（Ti）表面的细菌在NIR照射前后仍保持通常的圆形和饱满形态，其细胞膜没有明显损伤，维持了正常的生理结构和生长状态。相比之下，HT-Z/R样品在NIR照射后，细菌的细胞膜出现显著的凹陷和形态变形，表明其细胞膜结构严重受损。这些结果表明，抗菌机制可能涉及光热效应和Zn2?释放的协同作用。

在生物相容性测试中，研究人员首先测试了样品的亲水性，以初步评估其体外生物相容性。结果显示，经过水热处理后，样品的表面从疏水性转变为超亲水性，表明特定的纳米结构显著提高了钛基植入物的表面亲水性，这可能有利于细胞附着。接着，研究人员进行了MTT测试，以评估MC3T3-E1成骨细胞在不同样品上的细胞活性。结果显示，HT-Z/R样品的细胞活性优于HT和HT-Z组，表明RIS的释放有助于提高MC3T3-E1细胞的生物相容性。在共培养5天后，细胞活性达到118%。为了评估其体内生物相容性，研究人员将样品植入细菌感染的SD大鼠背部，并在植入7天后进行血液分析。结果显示，HT-Z/R样品的红细胞（RBC）、白细胞（WBC）和血小板（PLT）水平均未表现出明显的不良影响，表明所有样品对机体均无明显毒性。此外，NIR照射后的HT-Z和HT-Z/R组WBC数量有所下降，表明其对炎症有更好的治疗效果。同时，HT-Z/R组的中性粒细胞数量减少，进一步表明其优异的抗菌性能。此外，使用H&E染色观察了植入不同样品的大鼠主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织学变化。结果显示，HT-Z/R样品植入的大鼠主要器官未出现任何损伤或病变，表明该涂层在体内具有良好的生物相容性。

为了初步评估体外成骨能力，研究人员将MC3T3-E1成骨细胞与样品共培养7和14天，并测量成骨细胞的胶原分泌、碱性磷酸酶（ALP）活性和细胞外基质（ECM）矿化情况。结果显示，在7天的成骨诱导分化后，HT、HT-Z和HT-Z/R组的胶原分泌量显著高于纯钛组，其中HT-Z/R组的胶原分泌量达到135.4%。在14天的共培养后，胶原分泌量继续增加，HT-Z/R组的最高值达到155.2%。ECM矿化水平在HT、HT-Z和HT-Z/R样品表面也持续上升，所有组的矿化水平均高于纯钛组。其中，HT-Z/R组的矿化水平达到224%。此外，HT-Z/R组的ALP活性显著高于纯钛、HT和HT-Z组，分别达到13.40和27.81 U/mg蛋白。这些结果表明，RIS的释放在共培养过程中对成骨细胞的增殖和分化具有一定的促进作用。尽管HT-Z和HT-Z/R样品之间的差异并不显著，这可能是由于在共培养初期，RIS的快速释放并未显著影响细胞生长。除了抗菌作用外，Zn2?还对成骨细胞的增殖和分化表现出积极影响。据报道，约27.15 μM（约1.775 ppm）的Zn2?可以有效促进体外和体内的成骨过程。因此，HT-Z/R样品在共培养过程中释放的Zn2?和RIS可能共同促进骨整合，这表明该涂层在未来的骨科钛植入物表面改性中具有广阔的前景。

为了评估样品在体内的抗菌性能，研究人员还使用了大鼠皮下感染模型。将样品植入大鼠背部皮肤，并接种金黄色葡萄球菌。实验分为四组，包括Ti和HT-Z/R样品，分别在无NIR照射（NIR-）和有NIR照射（NIR+）条件下进行。红外热成像仪用于记录样品与组织界面的温度变化。结果显示，在NIR照射下，HT-Z/R组的温度在10分钟内可升高至约50℃，显著高于Ti组，表明HT-Z/R样品在体内表现出良好的光热性能。在植入7天后，从样品表面收集细菌并进行平板培养。在无NIR照射的情况下，HT-Z/R组的细菌数量比Ti组略有减少，表明其在黑暗条件下具有一定的抗菌效果，这与体外实验结果一致。而在NIR照射后，HT-Z/R样品的细菌数量显著减少，抗菌率达到96%，表明该涂层在NIR照射下具有优异的抗菌性能。此外，观察到植入部位周围组织未出现明显损伤，进一步证明了光热治疗的温度适合周围组织。

综上所述，本研究开发了一种结合ZIF-8负载RIS的微/纳米结构涂层，通过两步水热处理应用于钛基植入物。这种涂层能够在温和的水热温度下有效抑制细菌生长和生物膜形成，其抗菌性能来源于Zn2?释放和光热治疗的协同作用。此外，HT-Z/R样品表现出良好的生物相容性和潜在的成骨活性，这归因于Zn2?和RIS的释放。总体而言，这种表面改性策略为克服与植入物相关的感染和生物相容性问题提供了一种有效的解决方案。通过显著提高钛植入物的抗菌和成骨性能，该方法具有广阔的应用前景，有望在生物医学领域大幅提升钛植入物的临床性能。