延长保存牛卵巢来源合子CRISPR Cas9-RNP电穿孔基因组编辑的可行性及条件优化研究

本研究针对CRISPR-Cas9电穿孔技术在牛合子基因组编辑中因传统体外受精（IVF）流程导致操作时间不便及嵌合体率高等问题，利用延长保存（20–22小时）屠宰场卵巢来源的卵母细胞，系统优化了电穿孔电压（15–35V）和Cas9-RNP浓度（3μM与6μM）对胚胎发育和编辑效率的影响。研究发现30V电压结合6μM Cas9-RNP可在保持可接受胚胎发育率的同时显著提高编辑效率（81.5%），首次证实延长保存卵巢来源合子适用于高效基因组编辑，为优化大动物基因编辑技术提供了重要实践依据。

　　

随着CRISPR-Cas9技术的迅速发展，其在哺乳动物基因组精准编辑中的应用日益广泛，特别是在畜牧育种和生物医学研究中展现出巨大潜力。然而，该技术在牛等大动物胚胎中的应用仍面临两大挑战：一是传统体外受精（IVF）流程中，合子电穿孔的最佳操作时间多集中在午夜至凌晨，极大增加了实验操作的难度和人员负担；二是CRISPR-Cas9介导的编辑在合子阶段容易导致嵌合体（mosaicism）现象，即同一胚胎中同时存在编辑和未编辑的细胞，严重影响基因敲除（KO）的效率和后续动物模型的建立。

为解决上述问题，研究人员探索利用延长保存的屠宰场来源牛卵巢，以灵活安排实验时间，并系统优化电穿孔参数，旨在提高编辑效率、降低嵌合体率。本研究首次评估了延长保存卵巢（磷酸盐缓冲液，14–18°C，20–22小时）来源卵母细胞的发育能力，并在此基础上详细比较了不同电压（15V、20V、25V、30V、35V）和Cas9-核糖核蛋白（RNP）浓度（3μM与6μM）对胚胎发育和酪氨酸酶（TYR）基因编辑效率的影响。研究成果发表在《Theriogenology》，为大规模、高效制备基因编辑牛胚胎提供了重要技术参考。

在研究过程中，作者主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   延长保存牛卵巢的处理与卵母细胞采集：卵巢在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中14–18°C保存20–22小时，之后采集卵丘-卵母细胞复合体（COCs）并进行体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）。
2. 2.
   CRISPR-Cas9 RNP复合物的制备与电穿孔：针对牛TYR基因第一外显子设计gRNA，与Cas9蛋白形成RNP复合物，于受精后10小时（hpi）对合子进行电穿孔（Gene Pulser Xcell?系统），比较不同电压和浓度条件下的编辑效果。
3. 3.
   胚胎培养与基因型分析：胚胎在SOFaa培养基中培养至囊胚阶段，通过单囊胚PCR、Sanger测序及ICE（Inference of CRISPR Edits）分析编辑类型和效率，分类统计完全编辑（无野生型）、部分编辑和未编辑胚胎，并进一步分析等位基因编辑情况（单等位基因、双等位基因及嵌合型）。

研究结果

新鲜与延长保存卵巢来源卵母细胞的体外发育指标比较

延长保存卵巢来源的卵母细胞在分裂率（55.6 ± 6.2% vs. 58.9 ± 3.8%）、第7天囊胚形成率（18.4 ± 4.5% vs. 21.0 ± 4.7%）和第8天囊胚形成率（24.6 ± 4.9% vs. 27.3 ± 7.5%）方面均与新鲜卵巢组无显著差异，表明延长保存不影响卵母细胞的发育潜能。

电穿孔电压对囊胚编辑率的影响

在15V、20V和25V电压下，25V组编辑率最高（40.7%），显著高于20V（9.5%）和15V（0%）。但25V和20V电压下合子存活率和分裂率显著低于15V组。进一步提高电压至30V和35V，尽管囊胚发育率随电压升高而下降（35V组最低），但编辑率显著提高（30V: 66.7%；35V: 67.9%），且完全编辑（无野生型）胚胎比例显著增加（30V: 32.6%；35V: 37.3%；25V: 3.8%）。综合考虑发育率和编辑效率，30V被确定为最优电压。

电穿孔电压对囊胚编辑事件的影响

在25V电压下，单等位基因编辑比例较高（48.1%），而30V和35V电压则显著提高双等位基因编辑和嵌合型编辑的比例。完全编辑的囊胚中，30V和35V组嵌合体比例较高（35V: 41.1%；30V: 35.4%），但各组间纯合或杂合编辑比例无显著差异。

Cas9-RNP浓度对发育指标和囊胚编辑率的影响

在30V电压下，6μM Cas9-RNP浓度组的编辑率（81.5%）显著高于3μM组（60.0%），但两组在囊胚发育率（第8天囊胚率：16.3 ± 5.9% vs. 23.1 ± 7.1%）方面无显著差异。编辑类型分布（完全编辑、部分编辑、未编辑）及嵌合体比例在两种浓度下亦无显著差异。

研究结论与讨论

本研究首次证实，延长保存（20–22小时）的牛卵巢来源合子可用于CRISPR Cas9-RNP电穿孔基因组编辑，其发育能力和编辑效率与新鲜卵巢来源合子相当。通过系统优化电穿孔参数，发现30V电压结合6μM Cas9-RNP浓度可在保持可接受胚胎发育率的同时显著提高编辑效率，最高可达81.5%。

尽管提高电压和RNP浓度可增强编辑效率，但胚胎发育率随之下降，且嵌合体现象仍然普遍存在。这表明电压和浓度的优化虽能改善编辑组分的递送效率，但并不能完全解决编辑异步性问题。未来研究需进一步探索合子细胞周期的同步化策略，或开发新型编辑系统，以降低嵌合体率、提高双等位基因编辑比例。

该研究为CRISPR-Cas9技术在牛等大动物基因组编辑中的实际应用提供了重要技术优化方案，不仅显著提高了实验操作的灵活性，还为远程屠宰场卵巢资源的利用奠定了基础，对推动畜牧育种和生物医学研究具有重要意义。