由附近空化气泡引起的坑洞内气泡产生的冲击波

《Ultrasonics Sonochemistry》：Shockwaves from air bubbles within pits induced by nearby cavitation bubbles

本研究比较了间接（IUAE）和直接（DUAE）超声辅助提取法从野生总和（Rhus tripartita）果实中提取多酚的效率。采用响应面法优化参数，发现DUAE在53%功率、30分钟提取时间、80 mL/g液固比条件下效率最高，总多酚含量达26.74 mg GA eq/g DW。LC-MS和HPLC鉴定出10种多酚，其中新发现的masazinoflavanone占比82%，系首次系统量化。结果表明DUAE优于IUAE，且提取工艺符合绿色可持续要求。

　　本研究探讨了野生三裂槭（Rhus tripartita）果实作为抗氧化剂的潜力，旨在通过两种超声波辅助提取（UAE）技术——间接（IUAE）和直接（DUAE）——在预设条件下优化抗氧化剂的回收效率。通过响应面法（RSM）和Box-Behnken设计（BBD）对两种方法的提取参数进行了系统研究，聚焦于三个关键因素。总酚含量（TP-FC）被定义为响应变量，其范围在IUAE中约为6至12毫克GA当量/克干重（mg GA eq./g DW），而在DUAE中则从11到30毫克GA当量/克干重。二次模型的确定系数均超过0.9，这证实了模型的可靠性。方差分析（ANOVA）结果显示，温度和时间是IUAE中最重要的影响因素，而功率和时间则是DUAE中最为关键的因素。总体而言，DUAE比IUAE更高效，其最佳条件（53%功率、30分钟和80的液固比）下，总酚含量可达到26.74毫克GA当量/克干重。此外，研究还对通过DUAE获得的R. tripartita提取物的酚类成分进行了分析。利用液相色谱-质谱（LC-MS）初步识别了主要的酚类化合物，并通过高效液相色谱（HPLC）使用对应的标准品进行定量分析。最终明确识别了十种化合物，其中一种名为masazinoflavanone的双黄酮类化合物，首次于2005年被鉴定，现在被系统地量化，其含量高达36.6毫克/克干重，占总酚含量的82%。其他被识别的化合物包括更常见的分子，如amentoflavone、myricetin以及槲皮素衍生物，其含量范围在0.21至3.47毫克/克干重之间。

在植物提取领域，近年来，植物提取物和生物活性分子受到了广泛关注。许多研究表明，植物来源的化合物在应对各种疾病方面具有健康益处。尽管关于高价值栽培物种及其副产品已有大量数据，但许多野生植物仍被低估，尽管它们在资源利用方面具有巨大潜力。为了有效利用这些植物资源，一个可行的方法是借鉴传统知识，这些知识涉及它们在食品、医药和手工艺中的使用。Rhus tripartita，当地称为“Jedari”，是一种原产于北非和西亚温带地区的灌木，属于Anacardiaceae科的Rhus属，该属包含约250种常见的酸浆树。这些植物在传统医学中被广泛用于治疗炎症、胃肠道和心血管疾病。一些物种，如R. aromatica、R. chinensis、R. typhina和R. retinorrhae，已被广泛研究其化学组成和生物活性，已鉴定出超过200种化学化合物，涵盖多种化学家族（单宁、酚酸、黄酮类、花青素、萜类、精油等）。尽管酚类化合物对植物生存并非必需，但在物种进化、适应和抗逆性方面起着关键作用。其多样的结构和生物活性使其成为研究提取、鉴定、定量和生物活性评估的重点。

为了获得生物活性化合物，提取是关键步骤。超声波辅助提取（UAE）作为一种可持续、非热技术，为寻求提高提取产量、质量和过程安全的行业提供了经济可行的替代方案，同时符合环境法规。UAE在食品和制药行业中的应用日益增加，因其效率和对全球可持续发展目标的契合。技术上，UAE利用高能超声波，在20-60 kHz频率下操作，通过空化现象对植物细胞壁产生积极影响，从而减少时间、能源消耗和溶剂使用。实际上，该过程依赖于空化现象，即微气泡的生成和爆破，这有助于破坏植物细胞壁并增强溶剂渗透。此外，超声能还会提高介质温度，促进质量传递，增强粒子运动，并提高分子的溶解度。

在仪器方面，两种UAE系统被用于提取：(1) 间接超声波（超声波浴）和(2) 直接超声波（声探针）。在实验室规模下，间接超声波提取过程中，植物材料-溶剂混合物被置于水浴中，水浴将超声波能量传递至混合物。而在直接超声波提取中，声探针被直接浸入提取介质，将声能通过探针末端传递。两种系统均受多种参数影响，如超声波功率和频率、溶剂、温度、植物基质特性、液固比和提取时间。

响应面法（RSM）是一种广泛应用于多个研究领域的实验设计方法。这种方法是一种强大的统计工具，用于建模和优化涉及多个参数的过程。其主要目的是创建一个实验设计，以确定最佳的操作条件。此外，Box-Behnken实验设计（BBD）特别适用于RSM，它允许在三个实验条件下研究三个到七个因素（低、中、高）。本研究基于上述背景，旨在评估UAE在提取R. tripartita可食用果实中的酚类化合物效率。具体而言，比较了间接和直接超声波辅助提取（IUAE和DUAE）在酚类提取方面的可提取性。为此，应用了RSM和BBD来确定最佳提取条件。随后，利用LC-DAD-MS和HPLC-DAD对获得的富集提取物中的主要酚类化合物进行了表征和定量分析。

在实验设计部分，优化过程基于RSM，并选择了独立实验变量。这些变量基于先前经验和文献数据进行选择。因此，我们选择了基于BBD的三因素三水平方法，包括温度（°C）、时间（min）和液固比（mL/g），在IUAE中编码为X1、X2和X3；而在DUAE中，编码为Y1、Y2和Y3，包括功率（%）、时间（min）和溶剂/固体比（mL/g）。响应变量为R. tripartita果实提取物的总多酚含量，通过Folin-Ciocalteu方法进行量化。

在结果和讨论部分，提取是一种质量传递过程，其中目标化合物从植物基质中转移到周围的溶剂中。各种参数会影响从植物材料中提取的效率，例如温度、提取时间和材料与溶剂的比例。此外，在开发提取方法时，还需要考虑非毒性、成本效益和环境因素。EtOH-80满足这些要求，并被广泛用于从不同植物基质中回收生物活性物质。在相同背景下，UAE已被广泛用于多种植物物种的利用，如鹰嘴豆、野生迷迭香、苹果、姜、橄榄、澳洲坚果、咖啡等。事实上，超声波可以提高产量并减少溶剂和材料的浪费，以及能源消耗，相较于传统提取方法。同时，过程建模为环保提取提供了显著价值，因为它可以通过减少实验次数来确定最佳操作条件。这种方法可以减少材料使用并大幅降低实验室工作量。据我们所知，这是第一项针对鲜为人知的植物资源——野生酸浆或R. tripartita——进行酚类提取优化的研究。为此，果实被用于在不同的预定义条件下进行超声波辅助提取。然后，使用RSM和BBD对结果进行汇总，以确定提取富集的最佳条件。

在IUAE中，温度、时间以及液固比对酚类提取的效率有显著影响。这些因素被广泛研究，以确定它们的最佳平衡，从而提高目标分子的提取量，包括多酚。研究表明，提高温度和时间可以增强提取效率，但只有在一定范围内才有效，超过该范围可能导致降解。在本研究中，IUAE的提取时间被设定在20到40分钟之间，基于Sahin和Samli的研究，他们报告称在超声波作用下，20分钟内可回收90%的总酚类化合物。此外，Che等人的研究发现，多酚产量在30分钟时达到峰值。同时，选择40的液固比作为理想值，因此我们选择了20到80的液固比范围。关于温度，研究表明，提高温度可以增强质量传递，但过高的温度可能会降低提取速率常数，并导致酚类化合物的降解。因此，我们选择在25到45°C之间进行提取。

DUAE是UAE的另一种形式，其中超声波源直接浸入溶剂-植物材料混合物中。在本研究中，为了比较IUAE和DUAE的提取效率，选择了三个因素：功率（%）、时间（min）和液固比（mL/g）。在我们的实验条件下，温度无法被监控，因此将提取容器置于较大的水浴中，以散发超声波提取过程中产生的多余热量。此外，由于加热现象及其对酚类化合物的潜在降解作用，我们减少了提取时间，相较于IUAE减少了10分钟。功率被选为一个因素，因为它通常需要优化，尤其是在工业应用中。在剩余的超声波设备中，如振幅和脉冲/周期，根据先前实验（未发表）设定为90%和100%。

在IUAE中，15次实验的酚类产量范围在5.98至11.90毫克GA当量/克干重之间。在预定义的实验条件下，酚类产量可以翻倍。最高的酚类含量出现在温度（45°C）和时间（40分钟）的+1点，以及液固比（50 mL/g）的0点。而在DUAE中，产量范围在11.31至30.60毫克GA当量/克干重之间，远高于IUAE的结果，最高产量出现在功率（60%）和时间（30分钟）的+1点，以及液固比（50 mL/g）的0点。基于IUAE和DUAE的响应结果，DUAE比IUAE在从野生酸浆果实中回收酚类方面更为高效。这种产量增加可能归因于超声波在提取过程中的有效性，相较于浴系统。实际上，直接探针能够将超声波能量放大和集中，达到100倍。此外，直接浸入提取溶液中的探针可以减少质量传递阻力。

在统计模型部分，UAE过程中，超声波向植物材料施加额外能量，并通过空化现象破坏细胞壁，从而将目标生物分子推入溶剂中。为了更好地监控从野生酸浆果实中提取的酚类化合物，采用了经验性的二次多项式模型。所有实验数据通过Statgraphics软件和BBD进行整理。值得注意的是，BBD是一种三因素的因子组合，具有不完全块设计。每个块中，一个因素保持在中心点，而另外两个因素根据上、下限的四个不同组合值变化。

对于IUAE，实验数据的多元回归分析结果显示，温度、时间和液固比对酚类提取的效率有显著影响。温度被证实是最重要的因素，其次是时间和液固比。这体现在F比值最高和p值最低上。实际上，这意味着这些因素对IUAE从野生酸浆果实中提取的酚类产量有最大影响。此外，模型的决定系数（R2）和调整后的R2用于评估模型的拟合效果。对于IUAE，R2值为0.94，即94%的变量变化被模型解释。

对于DUAE，实验数据的多元回归分析结果显示，时间（Y2）和功率（Y1）是影响酚类提取的主要因素。这些参数以单个和平方形式具有最高的方差和F比值，并且p值低于0.05。值得注意的是，Y1的平方项对DUAE有负面影响，这在Pareto图中有所体现。此外，模型解释了超过98%的变量变化，如R2值所示。

在优化响应部分，本研究的主要发现之一是DUAE在从野生酸浆果实中获得富含抗氧化剂的提取物方面比IUAE更有效。这种产量的增加可以通过超声波在提取过程中的有效性来解释，相较于浴系统。此外，DUAE的提取时间较短，溶剂使用较少，这使其在食品和制药领域具有进一步应用的潜力。然而，值得注意的是，目前关于使用UAE处理R. tripartita材料的研究仍然较少。根据现有文献，只有El Maaiden等人使用UAE研究了从R. tripartita果实中提取的naringenin。他们发现，在10分钟的提取时间、1/60的固液比和75 W的振幅下，提取效率最高。此外，其他Rhus物种也接受了DUAE处理，例如中国酸浆（R. typhina）的抗氧化剂提取，但没有研究超声波参数（振幅、功率或脉冲）。

在DUAE的优化条件下，模型预测的抗氧化剂回收量为31.75毫克GA当量/克干重，而实际实验中获得了26.74±1.03毫克GA当量/克干重。通过单样本t检验，预测值和实验值之间的差异具有统计学意义。然而，需要注意的是，实验值并未显著低于预测值的95%下限（28.65毫克GA当量/克干重）。因此，该模型被验证有效。

在主要酚类化合物的鉴定和定量分析中，使用了HPLC技术。文献中关于R. tripartita果实中水醇提取物的HPLC定量研究非常有限。Abcha等人仅报告了使用HPLC-MS/MS对植物化学物质的定量分析，但未鉴定出masazinoflavanone。相反，他们报告了apigenin-7-O-glucoside和apigenin作为主要成分，其浓度与我们提取物中的masazinoflavanone相当。在加拿大酸浆（R. hirta）中，Wu等人定量分析了约20毫克/克干重的总酚类，其中caffeic acid 3-O-hexoside和gallic acid为主要成分。在Chinese酸浆（R. chinensis）中，quercetin-3-O-rhamnoside被鉴定为主要酚类。正如之前讨论的，大多数研究报道的总酚类含量是通过Folin-Ciocalteu方法测定的，这些结果也显示出相当大的变异性。例如，Itidel等人在来自七个不同地理来源的R. tripartita果实中定量分析了10至120毫克GA当量/克干重，而Jallali等人报告了39毫克GA当量/克干重。这种种内和种间变异性可能受到遗传和/或地理因素的影响，不仅影响总酚类含量，还影响提取物的化学组成。这两个方面对于确定植物材料的生物活性至关重要。因此，对植物提取物进行全面的化学表征是建立其生物活性与化学组成之间有意义联系的关键。

本研究的结果表明，R. tripartita果实的总酚类含量为30毫克GA当量/克干重，这一产量虽然低于一些文献报告的值，但它是通过环保的提取过程实现的，使用了食品级、可重复使用的溶剂（80%乙醇）而非危险的有机溶剂，且提取时间较短（30分钟，与传统方法的24小时相比）。这种短处理时间和适度的超声波功率也有助于降低能源消耗和劳动力成本。优化后的提取物进一步通过HPLC-DAD-MS进行表征，显示其含有黄酮类、双黄酮类、异双黄酮类、儿茶素、原花青素和缩合单宁。值得注意的是，一种名为masazinoflavanone的双黄酮类化合物被鉴定为主要成分，占总定量酚类含量的80%以上。此外，该化合物在传统医学中被认为具有与炎症相关的抑制作用，因此进一步研究其生物活性和与传统医学中R. tripartita所归因的生物效应之间的联系将有助于建立其治疗潜力的科学基础。这样的研究将最终为这一具有文化和生态重要性的植物资源提供科学支持。