溶藻弧菌噬菌体SHY-Vp8及其内溶素Lys59的分离鉴定与在水产养殖中的生物防治潜力

本研究针对水产养殖中溶藻弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引发的对虾大规模死亡问题，从养殖环境分离获得一株烈性噬菌体SHY-Vp8并鉴定其内溶素Lys59。该噬菌体具有短潜伏期(30min)、高裂解量(96PFU/cell)和优异的环境稳定性(耐受pH3-12、60℃)。基因组分析显示其不含毒力基因和抗生素抗性基因。内溶素Lys59在50μg/mL浓度下表现出强效裂解活性，且无需EDTA预处理即可穿透革兰氏阴性菌外膜，为水产养殖病害防控提供了新型绿色解决方案。

　　

在全球对虾养殖业中，溶藻弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染造成的死亡率超过90%，严重威胁粮食安全和经济可持续发展。传统抗生素使用导致耐药菌株产生和药物残留问题，而中草药制剂起效慢，拮抗菌应用存在效果不稳定和条件致病性风险。迫切需要开发高效、安全且成本效益高的新型生物抗菌剂。

噬菌体及其裂解酶因其宿主特异性强、不易产生耐药性和高效杀菌特性，被视为极具前景的生物防治策略。然而，噬菌体疗法存在宿主范围窄、易诱导细菌产生抗性突变等局限性，且某些噬菌体基因组可能携带抗生素抗性基因或毒力基因，存在水平转移风险。相比之下，内溶素(endolysin)作为噬菌体在裂解周期晚期表达的裂解酶，具有快速杀菌、低耐药性发展和广谱裂解能力等显著优势。

为此，研究人员从江苏如东县对虾养殖场及邻近河口区域采集样品，以实验室保存的Vp499为宿主菌，分离到一株烈性噬菌体SHY-Vp8，并对其生物学特性、基因组特征以及内溶素Lys59的抗菌活性进行了系统研究。该研究成果发表在《Virus Research》期刊上。

研究采用的主要关键技术方法包括：从养殖环境样品中通过双层琼脂法分离纯化噬菌体；透射电镜观察噬菌体形态特征；一步生长曲线测定潜伏期和裂解量；全基因组测序（Illumina NovaSeq平台）和生物信息学分析；内溶素基因克隆表达（使用pET-28a载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达）和蛋白纯化（镍柱亲和层析）；以及体外抗菌活性测定（监测OD₆₀₀变化）。

3.1. 噬菌体SHY-Vp8的分离纯化

从近岸海水样品中分离到10株噬菌体，其中SHY-Vp8对宿主Vp499的裂解活性最强。纯化后的SHY-Vp8在双层琼脂平板上形成规则圆形、清晰中心区、明显晕圈的典型裂解斑，初始滴度为9.5×10¹⁰ PFU/mL。

3.2. 噬菌体SHY-Vp8的形态特征

透射电镜显示SHY-Vp8具有典型的二十面体头部结构（直径40.89±0.32nm）和长的非收缩性尾部（长度77.28±0.45nm），分类属于长尾噬菌体科(Siphoviridae)。

3.3. 噬菌体SHY-Vp8滴度和最佳MOI

当感染复数(MOI)为1时，裂解液滴度达到峰值2.56×10¹⁰ PFU/mL，因此确定SHY-Vp8的最佳MOI为1。

3.4. 稳定性

SHY-Vp8在pH3-12范围内保持活性，在pH2.0时失活。在-20°C至60°C处理1小时后活性基本不变，70°C和80°C处理后果汁滴度分别下降2.9log和4.8log，显示其具有广泛pH耐受性和一定耐热性。

3.5. 一步生长曲线测定

SHY-Vp8的潜伏期为30分钟，上升期为40分钟（30-70分钟），在70分钟时滴度达到峰值9.60×10¹⁰ PFU/mL，裂解量为96PFU/细胞，表明其具有短潜伏期和高裂解效率。

3.6. 基因组特征和比较基因组分析

全基因组测序显示SHY-Vp8为58,525bp的线性双链DNA，GC含量46.38%。预测到85个编码序列(CDS)，其中31个编码功能特征蛋白。ORF59编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（内溶素Lys59）。未检测到tRNA或毒力基因。

3.7. 重组质粒构建和大肠杆菌表达系统构建

成功构建重组质粒， colony PCR验证显示1,044bp的特异性条带，表明重组质粒构建成功。

3.8. 裂解酶基因的表达纯化

重组蛋白在17.3kDa处检测到特异性条带，镍柱亲和层析纯化后获得纯度>95%的可溶性重组蛋白。

3.9. Lys59抗菌活性检测

Lys59的有效抗菌浓度范围为30-70μg/mL，最佳浓度为50μg/mL，此时OD₆₀₀降至0.385±0.006，裂解率达68.2%。Lys59无需EDTA预处理即可裂解Vp499，但EDTA预处理可使其裂解效率提高30-50%。

研究结论表明，噬菌体SHY-Vp8是一种严格裂解性长尾噬菌体，具有高效裂解能力（裂解量96PFU/细胞，潜伏期30分钟）和卓越的环境韧性（耐受pH3-12，60°C），其基因组不含溶原相关基因和抗生素抗性基因，符合国际噬菌体治疗中心(IPTC)的治疗性噬菌体候选标准。内溶素Lys59属于MurNAc-LAA家族，能够独立穿透溶藻弧菌外膜屏障，无需外膜透化剂即可表现出强效裂解活性。

该研究提出了弧菌病绿色防控的双重策略：噬菌体SHY-Vp8适用于养殖水体动态消毒，而工程化内溶素Lys59可延伸至食品加工链中的病原体拦截，共同减轻抗生素耐药性风险。这些优异的体外活性和特征为进一步开发体内感染模型和环境友好型生物防治剂奠定了坚实基础。未来研究将建立相关的溶藻弧菌感染水生动物模型，进行体内治疗效果试验，评估保护效果、宿主免疫反应和长期安全性，并为Lys59在海鲜加工链中的具体应用形式提供技术支持。