硫酸化多糖通过调控巨噬细胞-Treg细胞互作缓解糖尿病创面慢性炎症并促进愈合的机制研究

本研究针对糖尿病创面因慢性炎症和免疫失调导致的愈合障碍，开发了一种负载硫酸化壳聚糖（SCS）的微针（MN）递送系统（GelMa/SCS-MN）。研究人员发现SCS可协同IL-4激活STAT6/PPARγ信号通路，驱动巨噬细胞向M2表型极化并分泌CCL22，进而招募调节性T细胞（Tregs），形成双向调控回路，最终实现炎症消退和组织再生。该研究为糖尿病创面治疗提供了新型免疫调控策略，具有重要临床转化价值。

　　

糖尿病创面愈合是一个全球性的医疗挑战，其核心困境在于高血糖环境引发的慢性炎症和免疫失调。正常情况下，伤口愈合会经历止血、炎症、增殖和重塑四个有序阶段，但在糖尿病患者身上，这个精密过程被打乱了——中性粒细胞功能受损，巨噬细胞异常极化，更重要的是具有免疫调节功能的调节性T细胞（Tregs）数量和功能显著下降，导致炎症无法及时消退，上皮再生和血管形成受阻。尽管目前已有一些通过外源性补充细胞因子或细胞的治疗策略，但这些外源生物活性物质在糖尿病创面的炎症和高糖环境中难以存活和有效发挥作用。因此，开发能够主动调节免疫微环境的新型生物材料平台，成为解决这一临床难题的关键突破口。

在这项发表于《Bioactive Materials》的研究中，华东理工大学的研究团队创新性地将硫酸化壳聚糖（sulfated chitosan, SCS）这种化学修饰的多糖与微针结构相结合，构建了一个主动免疫调节递送系统。他们发现SCS的硫酸化结构域赋予了其协同的细胞因子结合能力，使材料在免疫调节方面具有增强功能。从机制上讲，SCS通过IL-4/STAT6-PPARγ级联驱动巨噬细胞极化，触发CCL22依赖的Tregs趋化作用。SCS建立了双向的巨噬细胞-Tregs串扰，通过M2表型稳定和Tregs介导的反馈回路实现自我维持的炎症消退。这种生物材料驱动的先天免疫和适应性免疫之间的协调，超越了被动的药物递送方法，在没有外源生物制剂的情况下有效减少炎症并促进伤口愈合。

研究人员为开展此项研究采用了多项关键技术：首先通过真空辅助灌注技术制备了GelMa/SCS-MN微针贴片，并对其机械性能和透皮递送能力进行了系统表征；利用链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型建立慢性创面模型；通过流式细胞术全面分析创面免疫细胞浸润和极化状态；采用RNA测序技术解析差异表达基因和信号通路；通过抗体耗竭实验（抗CD25单抗耗竭Tregs，氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞）验证细胞功能；建立GFP⁺脾细胞过继转移模型追踪细胞迁移；利用Western blot和qPCR分析关键信号分子表达；采用免疫荧光染色和ELISA等技术评估组织再生和炎症因子水平。

2.1. 微针贴片的制备与表征

研究人员首先通过真空辅助灌注技术制备了MN贴片，每个GelMa/SCS-MN贴片包含333个微针，呈圆形排列，锥形针高度为1020μm，基底直径为600μm。扫描电镜图像显示GelMa/SCS-MN贴片结构完整，排列整齐。压缩实验表明每根针可承受0.16N的压缩力，超过皮肤穿透所需的最小力。体外释放研究表明，约45%的SCS在模拟体液中前4小时内释放，24小时达到约94%。皮肤穿透实验证实微针尖端能够穿透表皮进入真皮浅层。荧光标记实验显示GelMa/SCS-MN能够有效将SCS递送到皮肤组织中。

2.2. GelMa/SCS-MN促进糖尿病小鼠创面愈合包括再上皮化和血管再生

在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，GelMa/SCS-MN治疗组在第7天和第11天的残余创面面积显著减少，分别为35.17%和4.04%，而对照组为63.21%和15.33%。免疫荧光染色显示GelMa/SCS-MN组表现出最显著的表皮细胞迁移距离，基底层的表皮细胞增殖也增强。在血管再生方面，GelMa/SCS-MN组表现出最小的创面血管间隙，更多增殖细胞围绕血管。CD31⁺Emcn⁺血管数量显著增加，表明其能够促进糖尿病创面的血管再生。H&E组织学染色显示GelMa/SCS-MN组显示出增强的愈合效果，胶原沉积更密集，表皮间隙显著缩小。

2.3. SCS激活糖尿病创面中Tregs介导的免疫反应

RNA测序分析显示，与对照组相比，GelMa/SCS-MN组有304个上调差异表达基因（DEGs）和339个下调DEGs。其中Foxp3、Ido1和Icos等免疫调节基因显著上调，这些基因与T细胞（包括Tregs）的激活和其免疫抑制能力的增强有关。GO分析显示上调的DEGs富集的通路包括角质形成细胞分化、皮肤发育、T细胞分化和激活等。流式细胞术分析显示，GelMa/SCS-MN治疗显著提高了创面中Tregs（Foxp3⁺）的比例，同时也影响了Tregs亚群的分布。

2.4. Tregs是糖尿病创面愈合所必需的

通过腹腔注射抗CD25单克隆抗体耗竭Tregs后，GelMa/SCS-MN贴介导的糖尿病创面愈合效果被削弱。Tregs缺失虽然不影响表皮细胞向创面的迁移，但显著抑制了基底表皮细胞的增殖。在血管再生方面，Tregs缺失显著抑制了创面组织中CD31⁺Emcn⁺内皮细胞的数量和密度，EdU⁺增殖细胞也显著减少。H&E染色结果显示，Tregs耗竭导致创面再生肉芽组织减少，虽然再上皮化在第14天完成，但瘢痕组织面积仍然较大。

2.5. 巨噬细胞是SCS诱导的Tregs募集的触发因素

KEGG通路富集分析显示，创面组织中上调的DEGs主要富集在T细胞受体信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。在检查的趋化因子基因中，只有Ccl17和Ccl22上调，其中Ccl22增加更多。蛋白水平分析证实GelMa/SCS-MN治疗显著提高了CCL22水平，而CCL17水平基本不受影响。巨噬细胞是CCL22分泌的主要来源，而CCL22受体CCR4在创面Tregs上强烈表达。通过氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞后，GelMa/SCS-MN对Tregs的招募作用减弱，激活的Tregs（ICOS⁺ Tregs和CTLA-4⁺ Tregs）比例也降低。过继转移实验进一步证实巨噬细胞在促进Tregs迁移中的关键作用。

2.6. SCS通过激活IL-4/Stat6-PPARγ信号通路调节巨噬细胞极化

流式细胞术分析显示，GelMa/SCS-MN贴片显著减弱了巨噬细胞向M1表型（CD86⁺CD206^-）的极化，同时促进了M1/M2巨噬细胞（CD86⁺CD206⁺）的比例。GelMa/SCS-MN贴片降低了促炎细胞因子（IL-6、IL-1β和IFN-γ）的水平，同时增加了促再生细胞因子（IL-10、PDGF-BB和KGF）的表达。对创面巨噬细胞的RNA-seq分析显示，GelMa/SCS-MN下调了Il1b、Tnfsf14和Il1f9等促炎基因，以及Cxcl3和Il23等中性粒细胞趋化基因，同时上调了抗炎表型相关基因Pparg和Ccl22。体外实验证实SCS与低浓度IL-4协同作用可增强STAT6磷酸化水平，促进Ccl22基因表达，而STAT6抑制剂（AS1517499）和PPARγ拮抗剂（GW9662）显著减弱了巨噬细胞中Ccl22基因表达。

研究结论和讨论部分强调，GelMa/SCS-MN贴片通过协调巨噬细胞和Tregs之间的相互作用来调节糖尿病创面内的免疫环境。Tregs在促进表皮再生、血管生成和维持巨噬细胞极化稳态方面发挥着必不可少的作用。在分子水平上，SCS作为关键激活剂，协同放大内源性IL-4信号传导。这种激活鼓励巨噬细胞采取抗炎状态并释放信号分子CCL22，随后将Tregs招募到创面区域。因此，SCS有效启动并维持有益的免疫反应，显著改善创面愈合。这些结果不仅阐明了一种先前未被认识的生物材料介导的Tregs激活机制，而且为利用免疫调节生物材料治疗慢性炎症性疾病奠定了基础。这种基于SCS的生物材料可广泛应用于治疗以Tregs缺陷或功能障碍为特征的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和银屑病。

该研究的重要意义在于开发了一种新型的免疫调节策略，通过生物材料设计利用内源性免疫，避免了外源性生物制剂的使用问题。GelMa/SCS-MN平台将SCS定位在创面床内，通过局部组织-SCS相互作用促进内源性CCR4⁺ Tregs的就地动员，减少了对脆弱的外源性细胞或囊泡产品的依赖。在这种微环境中，SCS增强并保持了巨噬细胞衍生的CCL22的稳定性，从而锐化了选择性的CCL22-CCR4趋化因子梯度，优先招募和稳定Tregs，并建立了一个自我强化的、有利于解决的免疫调节环境，适合恶劣的糖尿病创面环境。