老化氧化锌纳米颗粒长期低剂量暴露可促进乳腺癌MCF-7细胞迁移侵袭及特异性肝转移的机制研究

本研究针对纳米材料环境转化后的生物安全性问题，通过体外和体内实验证实：长期低剂量暴露于老化ZnO NPs（1.5 μg/mL）会显著增强乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导特异性肝转移现象。机制研究发现Claudin-2（CLDN2）蛋白表达上调是关键分子事件，其敲降可逆转促转移效应。该研究为评估转化态纳米颗粒的致癌风险提供了重要实验依据。

　　

在当代材料科学和医学领域，纳米颗粒的应用日益广泛，其中氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因其独特的理化性质和良好的生物相容性，被广泛应用于化妆品、药物载体和抗癌治疗等领域。然而，这些纳米颗粒一旦进入环境或人体，可能发生复杂的物理化学转化，形成"老化"状态，其生物效应也随之改变。尽管大量研究关注原始纳米颗粒的急性毒性，但对长期低剂量暴露于转化态纳米颗粒的潜在风险，特别是对癌症进展的影响，仍知之甚少。

乳腺癌作为全球女性最常见的恶性肿瘤，其转移是导致患者死亡的主要原因。当癌症发生远处转移时，患者的五年生存率会从早期的近100%骤降至26%。除遗传因素外，环境污染物也被认为是影响癌症发生发展的重要风险因素。传统重金属如砷、镉与乳腺癌转移的关联已有报道，但作为新兴污染物的金属氧化物纳米材料是否具有促癌转移效应，仍是一个亟待解答的科学问题。

更值得关注的是，当前对纳米材料的安全评价多基于其原始状态，而实际暴露场景中，纳米材料会经历环境老化过程。研究表明，ZnO NPs在模拟汗液、水环境等条件下会发生化学转化，形成磷酸锌、碳酸锌等物质，这些转化显著改变其生物学效应。先前研究发现，老化ZnO NPs虽然细胞毒性降低，但在人-仓鼠杂交细胞中表现出更高的致突变性，在小鼠胚胎成纤维细胞和裸鼠模型中具有更强的致癌性。这提示我们需要重新审视老化纳米颗粒的生物安全性。

为了解决这一问题，研究人员在《Biochemistry and Biophysics Reports》上发表了一项创新性研究，系统探讨了老化ZnO NPs对乳腺癌细胞转移能力的促进作用及其分子机制。

本研究主要采用以下关键技术方法：通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征纳米颗粒的理化性质；采用细胞活力检测确定亚毒性暴露浓度（1.5 μg/mL）；通过平板克隆形成、软琼脂集落形成、Transwell迁移和侵袭实验评估细胞恶性表型；建立裸鼠尾静脉注射模型进行体内转移验证；利用蛋白质印迹（Western blot）分析Claudin-2蛋白表达；通过shRNA敲降技术进行功能验证。

3.1. 新鲜和老化的ZnO NPs的表征

通过TEM观察发现，新鲜ZnO NPs呈不太规则的球形，晶体结构表面相对清晰，而老化NPs则呈现无定形态或模糊的晶体边界。动态光散射分析表明，两种状态的纳米颗粒在超纯水中易聚集，在细胞培养基中聚集程度显著降低。ICP-OES检测显示，老化过程在一定程度上影响了NPs的溶解性，但锌离子浓度的增加无统计学意义。

3.2. 短期暴露于新鲜和老化ZnO NPs后的细胞活力

细胞活力实验表明，在浓度不高于10 μg/mL时，新鲜和老化ZnO NPs均未显示显著细胞毒性，两种状态的NPs在细胞致死率方面无显著差异。在20 μg/mL的高浓度下，新鲜NPs显示出比老化NPs明显更高的细胞毒性（细胞活力<5%），而老化NPs处理的MCF-7细胞仍保持约25%的活力。

3.3. 新鲜和老化ZnO NPs对MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用

长期暴露实验显示，经过16周处理，新鲜NPs处理细胞的增殖能力较对照组显著增加。而老化NPs处理组的集落数量是对照组的2.2倍，新鲜组的1.66倍，且显著高于ZnCl₂组。软琼脂集落形成实验表明，老化NPs处理组形成的集落相对更大、数量更多。Transwell实验结果显示，老化NPs处理组的迁移细胞数量是对照组的10.2倍和新鲜组的1.94倍，侵袭细胞数量是新鲜组的2.44倍。

3.4. 新鲜和老化ZnO NPs对MCF-7细胞体内转移的促进作用

通过尾静脉注射建立肺转移模型，意外发现注射的MCF-7细胞未在肺部定植形成肿瘤，而是转移至肝组织。老化NPs处理组引起的肝转移负荷最为明显，肝脏中Ki-67蛋白表达水平较对照组高4.1倍，较新鲜组高1.84倍，表明老化NPs能特异性促进乳腺癌肝转移。

3.5. CLDN2可能参与新鲜和老化ZnO NP诱导的MCF-7细胞肝转移

Western blot分析显示，老化NPs处理导致CLDN2表达水平显著增加。通过shRNA敲降CLDN2后，经新鲜和老化ZnO NPs处理40代的MCF-7细胞的迁移和侵袭能力均减弱，表明CLDN2可能参与ZnO NPs诱导的MCF-7细胞肝转移过程。

研究讨论部分指出，乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，约三分之一早期诊断为非转移性乳腺癌的患者最终会发展为转移性疾病。纳米颗粒作为新型污染物，其毒性已被广泛研究，但大多数报告集中在新鲜NPs上。关于ZnO NPs的致癌性，先前研究使用野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF cells）及其同基因型8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1（Ogg1）敲除细胞，发现1 μg/mL暴露12周未能诱导细胞转化。而本研究采用更长的暴露时间（16周）和更敏感的检测指标，发现了老化NPs的促转移效应。

根据国际癌症研究机构（IARC）的报告，致癌物应具备特定特征，包括遗传毒性、改变DNA修复机制或基因组不稳定性、诱导氧化应激或慢性炎症、免疫抑制或永生化，以及改变细胞增殖和细胞死亡途径。结合先前研究发现，新鲜和老化ZnO NPs能促进肿瘤发生的起始、促进和侵袭性，且这种效应在老化NPs中更强。

关于特异性肝转移现象，研究发现Claudin-2（CLDN2）高表达与肝转移密切相关。Claudins是上皮和内皮细胞紧密连接链的支架蛋白，在细胞粘附、极性、通透性和腺体分化中起重要作用。研究表明，原发性肿瘤中CLDN2高表达的患者发生肝转移的比例显著更高。功能实验证明，CLDN2作为乳腺癌肝转移毒力基因，赋予循环乳腺癌细胞在肝脏微环境中增强的粘附、存活和增殖能力。CLDN2上调可能通过稳定CLDN2/ZO1/ZONAB复合物抑制NDRG1（N-myc下游调节基因1）表达，或通过MAPK信号通路促进癌细胞增殖、上皮-间质转化和淋巴结转移。

本研究也存在一定局限性：选择的单一浓度虽然作为模拟低水平慢性暴露的亚细胞毒性剂量是合理的，但缺乏剂量反应关系；实验性尾静脉注射模型虽然有效评估了外渗和定植过程，但绕过了原发性肿瘤侵袭和内渗等关键早期转移步骤，且未考虑原发性肿瘤微环境的影响。未来工作需要纳入一系列ZnO NPs浓度以建立量效曲线，并采用原位植入模型在生理相关环境中研究完整转移过程。

综上所述，本研究证实老化ZnO NPs能显著增强MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导特异性肝转移而非肺转移。机制上，这一过程伴随着CLDN2的上调，敲降CLDN2能显著减弱MCF-7细胞的增殖和迁移。这些发现证实了NPs随环境老化发生理化转化，转化后的NPs在促进癌细胞转移方面可能发挥更重要的作用，为NPs的健康风险评估提供了新的见解。然而，这只是初步尝试揭示潜在的分子决定因素，仍需大量进一步工作分析NPs在环境中的真实状态、行为和毒性，原始和转化态NPs的致癌性，并阐明NP增强致癌性的机制。