基于AlphaFold2的细丝蛋白机械结合蛋白计算筛选揭示新型力信号传导机制

本研究针对细丝蛋白（Filamin）机械敏感区（MSR）在力传导中结合伴侣难以系统性鉴定的问题，利用AlphaFold2计算筛选技术，成功识别出果蝇细丝蛋白Cheerio的Ig19结构域特异性结合蛋白。研究发现这些结合蛋白能特异性识别MSR开放构象，形成反平行β-片层结构，为机械信号传导机制研究提供了新范式。

　　

在细胞力学感知领域，细丝蛋白（Filamin）作为二聚化肌动蛋白结合蛋白，扮演着机械信号传导的关键角色。其机械敏感区（MSR, Mechanosensory Region）能够在静息状态下折叠成球状闭合构象，而在机械应力作用下展开为开放构象，暴露出多个蛋白质结合位点。然而，由于细丝蛋白结合靶标的高度情境依赖性，传统生化方法如酵母双杂交、共免疫沉淀等技术在系统性鉴定机械结合蛋白方面面临耗时久、假阳性率高、难以解析结合位点等挑战。

为突破这一技术瓶颈，研究人员在《Biochemistry and Cell Biology》上发表了创新性研究，采用深度学习辅助的蛋白质结构预测工具AlphaFold2，对果蝇（Drosophila melanogaster）细丝蛋白Cheerio的机械结合伴侣进行了大规模计算筛选。这项研究不仅验证了AlphaFold2在预测细丝蛋白构象变化方面的准确性，还成功识别出132个高置信度的机械结合蛋白，为理解机械信号传导机制提供了全新视角。

研究团队主要运用了以下关键技术方法：通过ColabFold-v1.5.5平台实施AlphaFold2-multimer-v2模型进行蛋白质复合物结构预测；利用预测对齐误差（PAE）和接触预测对齐误差（CPAE）作为结合置信度的量化指标；采用FlyBase和BioGRID数据库获取果蝇蛋白质序列和互作信息；使用ChimeraX和bio3d软件包进行结构分析和接触位点鉴定。

在结果部分，研究首先通过"ColabFold和Alphafold能预测细丝蛋白Ig结构域对的闭合状态"验证了预测工具的可靠性。研究发现ESMFold无法准确预测Ig16-Ig17和Ig18-Ig19结构域对的闭合构象，而ColabFold-AlphaFold2则成功预测了β-链阻断机制，其预测结果与已知晶体结构高度一致（RMSD值低于3.24?）。

在"ColabFold-AlphaFold2正确预测已知细丝蛋白结合区域"章节中，研究人员以整合素β亚基Myospheroid（Mys）为模型，证实AlphaFold2能准确识别细胞质尾部的结合位点。通过计算CPAE值，研究发现正确结合位点的CPAE值显著低于非特异性结合区域（<10 vs >10），建立了可靠的筛选标准。

"Kelch、Nuak和Hts中结合区域的鉴定"部分展示了该方法在已知互作蛋白中的应用效果。研究在Kelch蛋白的C端鉴定出三个结合区域（ASSFFSCLH、AVGGAVA、VGHIRLNA），在Nuak中发现FSTEMQHPV结合序列，在hu-li tai shao（Hts）中识别出FISEKHIQ关键结合区域，这些发现与既往遗传学和生物化学研究结果高度吻合。

在"新型细丝蛋白结合蛋白的筛选"核心章节中，研究团队对约1000个与肌原纤维、细胞骨架、激酶和蛋白质降解相关的候选蛋白进行了系统性筛选。从5247个预测模型中，筛选出132个CPAE值低于5的高置信度相互作用，对应84个潜在结合蛋白。值得注意的是，92%的高置信度模型显示反平行β-片层结合模式，且98%的结合发生在Ig19的38-45位点这一已知结合区域。

"Ig19和Ig17之间的差异"分析揭示了结合特异性模式。大多数候选蛋白能同时识别Ig17和Ig19，但34个蛋白显示对Ig19的特异性偏好，如线性泛素E3连接酶（LUBEL）仅与Ig19形成特异性结合。

最后，"高置信度配体不识别闭合MSR构象"的验证实验表明，所有高置信度结合区域都能特异性识别Ig17或Ig19的开放构象，而在包含阻断结构域（Ig16-Ig17或Ig18-Ig19）的闭合构象中，结合能力显著降低或完全消失，证实了这些相互作用具有机械敏感性。

研究结论表明，AlphaFold2计算筛选方法能有效识别细丝蛋白机械敏感结合伴侣，这些伴侣蛋白通过形成反平行β-片层结构特异性结合MSR开放构象。该方法不仅为机械信号传导机制研究提供了新工具，还为组织特异性机械信号网络研究奠定了基础。研究人员特别指出，大多数鉴定出的结合区域位于蛋白质内在无序区域，这一特征可能有助于解释细丝蛋白结合伴侣的多样性和情境依赖性。这项研究建立的计算筛选框架为大规模鉴定机械敏感性蛋白质相互作用提供了可行方案，有望推动力学生物学领域的快速发展。