Gallein通过抑制c-Jun N末端激酶抑制TGF-α诱导的肝癌细胞迁移

本研究针对肌肉内脂肪组织与代谢综合征风险增加的相关性，建立了一种新型永生化猪肌肉内前脂肪细胞系（通过HPV16-E6/E7和hTERT转染），探究了内质网(ER)/高尔基体应激（使用Brefeldin A诱导）及CREB3等因子在脂肪生成中的作用，发现ER应激可负调控脂肪生成标记物，为研究代谢疾病机制提供了重要细胞模型。

　　

随着全球Ⅱ型糖尿病（T2D）患病率的不断上升，深入研究影响此类健康风险发生机制的模型显得尤为重要。肌肉内脂质积累与胰岛素抵抗及代谢综合征、T2D的发展密切相关。然而，以往研究多依赖于小鼠3T3-L1细胞模型，该模型源于胚胎细胞而非特定脂肪库，且肌肉内前脂肪细胞原代培养存在快速衰老、分化能力有限的问题（通常不超过6代），严重限制了其在分子机制研究中的应用。此外，内质网（ER）和高尔基体应激对脂肪生成的影响虽已被初步揭示，但具体调控机制，尤其是CREB3等新型调节因子在肌肉内脂肪生成中的作用尚不明确。

为此，研究人员在《Biochemistry and Cell Biology》上发表了一项研究，成功建立了一个新型永生化猪肌肉内前脂肪细胞系，并利用该模型深入探究了ER/高尔基体应激对脂肪生成的影响。该细胞系通过转染人乳头瘤病毒16型E6/E7基因（HPV16-E6/E7）和端粒酶逆转录酶（hTERT）实现永生化，克服了原代细胞衰老快、分化能力差的局限，稳定传代超过24代仍保持强劲脂肪分化能力。

研究主要采用了以下关键技术方法：从3日龄约克夏×长白猪仔猪longissimus dorsi肌肉中分离原代细胞，经胶原酶消化获得基质血管组分（SVF）；使用核转染法共转染HPV16-E6/E7和hTERT质粒进行细胞永生化；采用两种脂肪诱导培养基（DMI 1和DMI 2，含不同浓度地塞米松(DEX)）诱导分化；通过油红O染色和甘油三酯测定评估脂质积累；利用液滴数字PCR（ddPCR）和qRT-PCR分析脂肪生成、脂代谢及应激相关基因表达；蛋白质表达通过Western blot检测；使用布雷菲德菌素A（BFA）诱导ER/高尔基体应激。

永生化肌肉内前脂肪细胞模型在长期传代后仍保持分化潜能

研究人员从猪longissimus dorsi肌肉中分离出前脂肪细胞，并通过表达HPV16 E6、E7及hTERT基因成功实现了细胞的永生化。这些细胞在传代超过24次后仍未出现衰老或复制阻滞迹象。qRT-PCR检测证实HPV16 E7基因稳定表达（图1B）。诱导分化后，细胞呈现明显的脂质积累（油红O染色阳性）且甘油三酯含量显著增加（DMI 1, p = 0.0013；DMI 2, p = 0.0028）（图1C）。数字PCR显示脂肪生成标记物FABP4在分化细胞中表达略有上升（图1D），表明该细胞系具有稳定且持久的分化能力。

分化诱导后脂质代谢和应激反应靶点的差异表达

通过ddPCR和qRT-PCR对分化细胞中脂质代谢和ER应激相关基因进行探索性分析发现，分化细胞中脂质代谢相关基因（如PPARGC1A、SCD和LPL）表达上调，而ER应激相关基因（如ATF6、ARF4、NR3C1和CREB3）表达下调（图2）。Western blot结果进一步证实PGC-1α和CREB3的蛋白表达与基因表达变化一致（图2D）。

ER/高尔基体应激剂布雷菲德菌素A处理后脂肪生成和应激相关标记物的表达改变

为研究ER/高尔基体应激对脂肪生成的影响，研究人员使用BFA处理细胞。结果显示，BFA应激导致脂肪生成标记物FABP4表达降低（非诱导组p = 0.054；D7组p = 0.050），而SCD、NR3C1和ARF4等在DMI诱导的细胞中表达增加（图3B）。同时，应激反应基因ATF6和CREB3的表达也显著上升，且CREB3的激活形式（N末端片段）在BFA处理下被检测到（图3C），表明CREB3在应激条件下可能发挥转录调节功能。

布雷菲德菌素A对分化诱导过程中脂肪生成和应激相关标记物表达的影响不显著

进一步分析发现，尽管BFA处理能诱导某些应激相关基因表达，但在分化7天的细胞中，与未应激组相比，BFA并未显著改变FABP4和LPL等脂肪生成标记物的表达（图4）。这表明急性BFA处理虽能激活应激反应通路，但不足以逆转脂肪生成过程。

讨论与结论

该研究成功建立了一个新型永生化猪肌肉内前脂肪细胞系，为研究肌肉内脂肪生成及代谢调控提供了可靠模型。该模型不仅克服了原代细胞易衰老的局限，还保留了长期分化能力，适用于分子机制研究。研究发现，脂肪生成过程中脂质代谢基因表达上调，而ER应激相关基因（如ATF6、ARF4和CREB3）表达下调，提示ER应激可能与脂肪生成负相关。BFA诱导的ER/高尔基体应激可激活CREB3等因子，但急性应激处理未能显著改变脂肪生成进程，表明慢性应激可能在代谢调节中扮演更重要的角色。

该研究强调了ER应激在脂质代谢中的调控作用，尤其是CREB3作为新型代谢调节因子的潜力。研究结果为进一步探索代谢疾病（如肥胖和T2D）的分子机制提供了重要线索，也为开发针对肌肉内脂肪积累的治疗策略奠定了理论基础。