利用Komagataella phaffii精密发酵生产重组牛乳铁蛋白的结构与功能研究及其在健康应用中的生物相似性验证

本研究针对天然牛乳铁蛋白(bLf)产量低、成本高的问题，通过精密发酵技术利用Komagataella phaffii酵母生产重组牛乳铁蛋白(rbLf)。研究团队通过多维度结构表征和功能分析，证实rbLf与天然bLf在分子量、等电点、氨基酸序列等结构特征上高度一致，且保留了铁结合释放能力、肠道受体结合、上皮细胞增殖促进（>120%对照, P<0.0001）、病原菌抑制（>50%减少, P<0.0001）、LPS结合（+4倍, P<0.001）和TLR4拮抗（>40%减少, P<0.0001）等关键生物活性。该研究为扩大乳铁蛋白在婴幼儿和成人健康产品的应用提供了重要科学依据。

　　

在当今健康食品和医疗营养领域，牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin, bLf)作为一种多功能的铁结合糖蛋白，一直备受关注。它不仅具有强大的抗菌和免疫调节特性，还被证明能够减少呼吸道感染、坏死性小肠结肠炎和迟发性败血症等疾病风险。然而，天然bLf在牛奶中含量极低，商业化生产成本高昂，这严重限制了其广泛应用。据统计，2019年全球bLf产量的69%都用于婴幼儿营养市场，但日益增长的科学证据表明，bLf在铁调节、肠道健康和免疫健康方面对普通人群同样具有重要价值。

面对供应短缺的挑战，精密发酵技术(precision fermentation)为大规模生产蛋白质提供了一种高效且可持续的解决方案。该技术平台已被商业用于生产结构和功能与天然形式相当的发酵源乳清和蛋清蛋白，但应用于其他高价值生物活性蛋白仍存在固有限制。特别是翻译后修饰(Post-Translational Modifications, PTMs)，如糖基化、磷酸化和二硫键形成，会因生产宿主的不同而有所差异，从而可能显著影响功能蛋白的生物活性。

为了解决这一难题，研究人员开展了一项创新性研究，利用Komagataella phaffii（先前称为Pichia pastoris）酵母生产重组牛乳铁蛋白(recombinant bovine lactoferrin, rbLf)，并全面评估其与天然bLf的结构和功能相似性。这项研究最近发表在《Biochemistry and Cell Biology》上，为扩大这种高价值成分的市场应用提供了科学依据。

为了全面评估rbLf的特性，研究人员采用了多种先进的技术方法。他们通过液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)进行了完整的蛋白质鉴定和糖基化分析，使用基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和高分辨率质谱测定了分子量。通过圆二色谱(CD)和微流调制光谱(MMS)分析了蛋白质的二级结构，利用核磁共振(NMR)研究了三级结构。功能研究包括铁结合和释放实验、肠道细胞(Caco-2和HIEC)受体结合和增殖实验、抗菌活性测定（针对肠致病性大肠杆菌EPEC）、脂多糖(LPS)结合实验以及Toll样受体4(TLR4)拮抗实验。所有实验均以商业来源的天然bLf样品作为对照。

蛋白质生产和纯度

研究人员通过K. phaffii发酵生产rbLf，发酵液经过离心澄清、微滤过滤，并通过离子交换色谱纯化，最后进行缓冲液交换和喷雾干燥。三个批次的产品分析显示，rbLf具有高蛋白含量和高纯度（接近100%），杂质主要是发酵液和加工缓冲液中的盐和碳水化合物残留。

蛋白质鉴定

分子量分析显示rbLf为84 kDa，与天然bLf的82-83 kDa相当。Western blot分析使用两种不同的多克隆抗体证实了rbLf和bLf具有相似的免疫反应性谱。Edman测序检测到rbLf蛋白N末端存在两种不同序列，主要序列与预期bLf序列相同，但同时存在四个氨基酸延伸(EAEA)，这源于酿酒酵母α因子分泌信号前序列。

糖基化分析

研究发现rbLf主要含有高甘露糖型N-连接聚糖，这与天然bLf中约50%的聚糖结构相似。rbLf中鉴定出20种N-聚糖（包括异构体），其中9种独特结构均为高甘露糖型。最重要的发现是，rbLf的高甘露糖N-聚糖不会通过DC-SIGN受体异常刺激免疫系统，这解决了关于酵母衍生糖蛋白可能引起免疫识别的安全担忧。

蛋白质结构特征

高效液相色谱(HPLC)图谱显示rbLf和bLf具有相似的保留时间和峰特性。二级结构分析显示rbLf含有22.5±9.2%的α-螺旋、17.5±8.8%的β-折叠和13.1±1.2%的转角，与先前报道的bLf变异性重叠。NMR光谱表明rbLf和bLf的蛋白质结构非常相似，但rbLf的糖基化程度更高。等电点测定显示rbLf的pI值为9.4，与理论值非常接近，落在bLf先前报告的变异性范围内。

体外消化

通过胰蛋白酶消化的LC-MS/MS分析确定了110个rbLf和bLf共有的肽段，序列覆盖率达86%。蛋白质消化校正氨基酸评分(PDCAAS)显示rbLf能够有效消化，尽管程度略低于参考bLf，这可能是由于糖基化变异在切割位点造成的空间位阻。

功能表征

铁结合研究表明，rbLf的铁饱和度接近87.6%，属于全铁形式(holo-form)，能够在低pH条件下释放铁(8.4±6.8%)，并在中性pH条件下重新与铁结合(73.1±9.41%)，这与天然bLf没有显著差异。抗菌活性实验表明，铁饱和的rbLf在12小时后能显著抑制肠致病性大肠杆菌(EPEC)的生长，效果与bLf相当。LPS结合实验显示rbLf与LPS的结合能力比基线高3-4倍，且能抑制LPS诱导的TLR4活性约50%。肠道上皮细胞研究证实，rbLf能够与肠道Lf受体结合，并促进人类肠道隐窝样细胞(HIEC)的增殖，效果与bLf相当。

研究结论表明，K. phaffii发酵衍生的rbLf在结构和功能上与bLf具有生物相似性。尽管rbLf的N末端存在四个氨基酸延伸，但没有证据表明这会改变蛋白质折叠、消化性或生物活性。rbLf仅含有高甘露糖型N-连接聚糖结构，与bLf中约45%的结构异构体相似，虽然bLf还含有酵母生产系统中不存在的其他杂合和复杂结构，但rbLf中没有新颖结构，且没有证据表明这种多样性缺乏会导致功能显著丧失。

更重要的是，乳铁蛋白的特征性核心结构——N端和C端的两个铁结合瓣，在所有已知物种中都是保守的。功能分析证实，rbLf分子在pH依赖性铁释放和结合能力方面与bLf相同。rbLf增加的铁饱和度不会改变其抗菌活性，如对肠道病原体EPEC的直接抑制、LPS结合和对TLR4受体的LPS拮抗作用。最后，肠道上皮受体结合和增殖实验证明，rbLf和bLf在调节肠道健康方面具有相同的功效。

这项研究证实，糖基化谱和糖基化占据位的微小差异不会影响rbLf的结构-功能关系。总体而言，发酵衍生的rbLf保持了与bLf的结构和功能相似性，肯定了精密发酵技术作为生产生物相似食品成分的有效平台。这一突破性研究不仅为解决乳铁蛋白供应短缺问题提供了可行方案，也为其他高价值生物活性蛋白的生产开辟了新途径，有望推动婴幼儿和成人健康产品市场的创新与发展。