一种用于从五叶参（Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)）中合成稀有人参皂苷的新UDP-糖基转移酶

《Carbon Neutral Technologies》：A new UDP-glycosyltransferase for rare ginsenoside biosynthesis from Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)

UDP-糖基转移酶在人参皂苷生物合成中起关键作用，但现有酶种类有限且效率不高。本研究从葫芦科植物五加皮（Gynostemma pentaphyllum）转录组中筛选出新型糖基转移酶基因GpUGT74A1，经MBP融合标签在大肠杆菌中实现可溶表达。体外酶活性实验表明，该酶能特异性催化PPD、PPT和Rh2的C-20羟基糖基化，分别生成CK、F1和F2皂苷。研究不仅丰富了植物来源糖基转移酶家族成员，更为稀有皂苷的异源生物合成提供了新候选酶。

　　

吴桥香|陈阳阳|叶明星|陈圆萍|袁晓轩|刘晓芬|黄泽豪|徐少华|徐伟|李华|冯亚倩

福建中医药大学药学院结构药理学与中药化学生物学研究所，中国福建省福州市350122

摘要

作为潜在药物候选物的 Ginsenosides 的异源生物合成目前是一个研究热点。其生物合成途径中的关键下游酶 UDP-糖基转移酶（UGTs）的挖掘不足，限制了可生物生产的 Ginsenosides 的种类和产量。由于 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）是目前已发现的非五加科植物中唯一含有 Ginsenosides 的植物，因此该植物中参与 Ginsenosides 合成的酶具有很大的开发价值。在本研究中，从 G. pentaphyllum 中分离出一种新的糖基转移酶，并根据序列同源性将其归类为 UGT74 家族，命名为 GpUGT74A1。与其他已报道的 UGTs 相比，GpUGT74A1 的序列同源性较低。尽管 GpUGT74A1 在 Escherichia coli 中克隆和表达时几乎完全不溶于水，但通过与其 MBP 溶解标签融合成功实现了其可溶性表达。体外 酶活性实验表明，它可以催化 Ginsenosides PPD、PPT 和 Rh₂ 的 C-20 位糖基化，分别生成 Ginsenosides CK、F₁ 和 F₂。本研究进一步丰富了植物来源的糖基转移酶基因序列，为稀有 Ginsenosides 的异源合成提供了新的候选元件。

引言

Ginsenosides 作为 Panax 属 的主要活性成分，具有多种药理作用，并展现出新药物开发的潜力[1, 2, 3, 4]。然而，Panax 属药用植物的生长周期较长且栽培成本较高，再加上药材中单体的多样性、含量低以及分离困难[5]，限制了 Ginsenosides 作为药物的发展。为了缓解药用资源短缺的压力，Ginsenosides 的异源生物合成及其定向制备[6]（尤其是稀有 Ginsenosides[7]）受到了广泛关注。

UDP-糖基转移酶（UGTs）介导的糖基化是天然产物生物合成的最后一步，对形成其结构及维持功能多样性至关重要[8]。从药用植物中挖掘新的 UGTs 并研究其催化机制已成为中药资源研究的热门领域。包括人参、美参和三七在内的爵床科植物中的 UGTs 基因已被逐步鉴定，并应用于某些 Ginsenosides（如化合物 K（CK）、Ginsenoside F₁、Rh₂、Rg₁ 和 F₂）的异源生物合成[9]。然而，目前已鉴定的 UGTs 仍然较少，许多具有复杂糖基结构的 Ginsenosides 尚未实现完全生物合成。此外，许多 UGTs 在实际应用中表现出较低的催化效率和较差的位点选择性，导致异源生物合成的产量不理想[10]。因此，鉴定和表征新的 UGTs 具有重要意义。

除了继续探索五加科植物中的候选 UGT 序列外，一些研究人员还在其他物种中寻找可用于稀有 Ginsenosides 异源合成的 UGTs。例如，除了人参中的 UGTPg45（催化效率较低[11]）外，Arabidopsis thaliana 中的 UGT73C10[12]、Medicago truncatula 中的 UGT73F3[13]，甚至 Bacillus subtilis 中的 Bs-YjiC[14] 都可以催化 Protopanaxadiol 的 C-3 羟基糖基化，从而获得稀有皂苷 Rh₂。

Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）是迄今为止发现的唯一一种含有 Ginsenosides 的葫芦科植物[15]。考虑到这两个科之间的系统发育距离，G. pentaphyllum 中的 UGTs 序列可能与五加科植物的 UGTs 有显著差异。然而，G. pentaphyllum 中的 UGTs（GpUGTs）尚未得到充分研究。目前仅克隆并鉴定了九种 GpUGTs 并确定了其功能[16]。在本研究中，从 G. pentaphyllum 的转录组数据中筛选出一种名为 GpUGT74A1 的候选 UGT 序列。设计了针对 GpUGT74A1 的特异性引物进行克隆和表达，随后进行了 体外 酶活性测试，最终鉴定出一种具有活性的新 UGT 基因。

实验部分

植物材料

从福建中医药大学药用植物园（中国福建省）收集了 Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino 的新鲜叶片。该植物材料由福建中医药大学的高级实验师徐惠龙教授鉴定为 G. pentaphyllum（葫芦科）。叶片用蒸馏水清洗后风干，液氮快速冷冻，并储存在 ?80 °C 下以备后续使用。

试剂

20(S

GpUGT74A1 的生物信息学分析

G. pentaphyllum 的转录组分析鉴定出一种高表达的糖基转移酶候选基因 GpUGT74A1，其开放阅读框（ORF）长度为 1,407 bp，编码 468 个氨基酸，预测分子量为 52.5 kDa。序列比对显示，GpUGT74A1 与已报道的黄酮类 3-/7-O-糖基转移酶 UGT76E11（PubMed ID: 11130713）的同源性最高（33.62%），与 G. pentaphyllum 中已知的糖基转移酶 GpUGT1 的同源性为 29.92%

讨论

稀有 Ginsenosides 在药物开发中具有显著价值[19]。例如，CK 作为一种潜在的临床抗癌剂，可通过抑制细胞周期来治疗前列腺癌[20]；F₁ 可促进 UCP1 依赖的脂肪褐变并改善肥胖相关的胰岛素抵抗[21]；Rg₁ 可通过激活 mTOR 信号通路抑制自噬，成为治疗脑缺血/再灌注损伤的有希望的药物候选物[22]。然而，这些

CRediT 作者贡献声明

陈阳阳：撰写 – 原始草稿，数据整理。陈圆萍：软件操作，数据整理。叶明星：实验研究，数据整理。徐少华：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源协调，项目管理，资金筹集。黄泽豪：资源协调，资金筹集。刘晓芬：资源协调，资金筹集。袁晓轩：监督，实验研究，数据整理。吴桥香：撰写 – 原始草稿，实验研究，数据整理。冯亚倩：资源协调，资金筹集。

利益冲突声明

作者声明与本文内容不存在利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82104321）、福建省科技创新联合基金项目（2024Y9507）、福建省自然科学基金（2023J05168）、福厦泉国家自主创新示范区特色中药材生产关键技术合作创新平台项目（福州市科技计划项目编号 2023-P-005）等项目的支持。