肝细胞癌细胞系中由转谷氨酰胺酶2介导的多胺化蛋白质的鉴定

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Identification of Transglutaminase 2 mediated polyaminated proteins in a hepatocellular cancer cell line

本研究利用两种标记多胺探针，通过质谱分析鉴定出TGM2依赖的聚胺化修饰的51种蛋白质和66个位点，涉及翻译和细胞骨架调控，并首次在体内验证了Grb10的聚胺化修饰。

　　本研究探讨了聚胺（polyamines）在细胞内的作用及其作为蛋白质翻译后修饰（post-translational modification, PTM）的潜力。聚胺是一类广泛存在于细胞中的代谢产物，它们参与多种细胞过程，包括细胞健康、DNA复制、基因表达、蛋白质翻译和细胞增殖等。尽管聚胺在细胞中具有广泛的生物学作用，但目前对其具体功能的了解仍然有限。大多数关于聚胺作用的研究通常将它们视为一种带有净正电荷的分子，因此认为其主要影响是通过改变细胞内的电荷环境实现的。然而，近期的研究表明，聚胺可以通过一种更具体的方式——聚胺化（polyamination）——对蛋白质进行修饰，这种修饰方式由转谷氨酰胺酶（transglutaminases, TGMs）催化，通过转酰胺反应将聚胺连接到目标蛋白的谷氨酰胺残基上。本研究利用了一种特殊的细胞模型，以系统地鉴定TGM2介导的聚胺化靶点，并揭示了其在癌症中的潜在作用。

### 1. 聚胺的功能与聚胺化机制

聚胺在细胞中的作用不仅仅局限于其作为正电荷分子的普遍影响，它们还能够作为特定的翻译后修饰分子，对某些蛋白质的功能产生影响。例如，精胺（spermidine）是eIF5A蛋白中形成一个名为“hypusine”的关键结构的前体，这一过程对蛋白质翻译至关重要。此外，一些研究表明，聚胺可以与特定的蛋白质结合，通过改变其结构或功能来影响细胞活动。例如，来自布氏杆菌（*Bordetella*）的皮肤坏死毒素（dermonecrotizing toxin）能够通过聚胺化宿主细胞中的Rho蛋白（在Q63位点）来引发病理性毒性反应。这些例子表明，聚胺化不仅是对蛋白质的修饰，还可能在细胞信号传导和疾病发生中发挥重要作用。

在本研究中，研究者关注的是TGM2，这是一种广泛表达且研究最为深入的转谷氨酰胺酶。TGM2不仅能够将聚胺连接到蛋白质的谷氨酰胺残基上，还能够催化其他类型的酰胺化反应，如serotonylation和dopaminylation。因此，TGM2在聚胺化过程中扮演着关键角色。研究者发现，在一种由小鼠肝癌细胞系衍生的CB1细胞中，TGM2是唯一参与聚胺化反应的酶，这使得CB1成为研究TGM2介导的聚胺化反应的理想模型。

### 2. 研究方法与实验设计

为了系统地鉴定TGM2介导的聚胺化靶点，研究者采用了一种创新的方法。他们使用了两种不同的标记聚胺：生物素标记的戊胺（Biotin-pentylamine, Bt-PA）和二硝基苯胺标记的戊胺（DNP-pentylamine, DNP-PA）。这两种标记物具有不同的分子量，使得它们在后续的质谱分析中可以被区分开来。研究者利用这些标记物对CB1细胞进行体外和体内实验，通过免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）富集聚胺化蛋白，并结合质谱分析技术（mass spectrometry, MS）进行鉴定。

在体外实验中，研究者将CB1细胞的全细胞裂解物与标记聚胺反应，并通过免疫沉淀技术富集被修饰的蛋白质。为了验证TGM2在聚胺化反应中的作用，他们还使用了TGM2特异性抑制剂Z-DON。实验结果显示，只有在TGM2存在的情况下，聚胺才会被成功修饰到目标蛋白上。而在TGM2被敲除的细胞裂解物中，没有检测到任何被修饰的肽段，这进一步证明了TGM2在聚胺化反应中的必要性。

在体内实验中，研究者将CB1细胞直接暴露于标记聚胺，并通过免疫沉淀富集被修饰的蛋白质。他们发现，体内聚胺化效率低于体外实验，这可能是由于体内环境中聚胺修饰的复杂性和检测方法的局限性。尽管如此，他们仍然成功地检测到了一些关键的聚胺化靶点，如Grb10蛋白。

### 3. 聚胺化靶点的鉴定与功能分析

通过质谱分析，研究者共鉴定了51种被聚胺修饰的蛋白质，涉及66个不同的谷氨酰胺受体位点。其中，许多靶点与翻译过程或细胞骨架组织有关，这些蛋白质在癌症中具有重要作用。例如，Actin、Tubulin、Filamin A和Zyxin等结构蛋白被聚胺化，这可能影响细胞形态和运动能力。此外，一些与翻译相关的蛋白质，如Eef1a1、Eef1g、Eif4a1、Eif4b和Eif4h，也被发现受到聚胺化修饰。这些结果表明，聚胺化可能在调控蛋白质翻译过程中发挥作用。

研究者还发现了一些新的聚胺化靶点，这些靶点此前未被报道过。例如，他们检测到了Gapdh（糖酵解酶）和Grb10（一种mTORC1的负调控因子）的聚胺化修饰。Grb10的聚胺化发生在Q475位点，而这一位点正好位于两个被mTORC1磷酸化的丝氨酸残基之间。这提示我们，聚胺化可能与其他翻译后修饰（如磷酸化）之间存在相互作用，从而在细胞信号传导中发挥协同作用。

为了进一步验证这些结果，研究者还进行了基因本体（Gene Ontology, GO）分析。分析显示，被聚胺修饰的蛋白质主要参与蛋白质翻译、RNA代谢和细胞骨架组织。这表明，聚胺化可能在这些生物学过程中具有重要作用。然而，研究者也指出，这些结果可能受到样本中蛋白质丰度的影响，因为许多被检测到的蛋白质是高度表达的，如Actin、Tubulin和Gapdh，这可能使得它们更容易被检测到。因此，研究结果可能偏向于这些常见的蛋白质，而忽略了其他潜在的靶点。

### 4. 研究的意义与局限性

本研究是首次对TGM2介导的聚胺化进行大规模蛋白质组学分析，揭示了聚胺化在细胞功能调控中的重要性。通过使用标记聚胺和质谱分析技术，研究者能够识别出大量被聚胺修饰的蛋白质，这为理解聚胺化在癌症和其他疾病中的作用提供了新的视角。此外，研究者还发现，聚胺化可能与其他翻译后修饰（如磷酸化和SUMO化）存在交叉调控，这种调控机制可能在细胞信号传导中具有重要意义。

然而，研究也存在一定的局限性。首先，所使用的标记聚胺（Bt-PA和DNP-PA）具有5个碳的聚胺链，与体内常见的聚胺（如腐胺、精胺和精脒）相比，其结构并不完全相同。因此，这些标记物可能无法完全模拟体内聚胺的修饰特性。其次，质谱分析技术在检测聚胺化肽段时存在一定的困难，导致许多潜在的聚胺化靶点未能被识别。此外，尽管研究者采用了多种方法（如使用不同的标记物、进行重复实验）来减少误差，但结果仍可能受到实验条件和检测技术的限制。

### 5. 实验方法与技术细节

为了确保实验的准确性和可重复性，研究者采用了严格的实验方法。首先，CB1细胞系是从小鼠肝癌肿瘤中分离出来的，并且该细胞系中TGM2的表达水平显著高于正常肝细胞。为了验证TGM2在聚胺化反应中的作用，研究者对CB1细胞进行了CRISPR敲除实验，以去除TGM2基因。结果显示，TGM2的缺失显著降低了聚胺化反应的效率，这进一步支持了TGM2在聚胺化中的关键作用。

在蛋白质富集过程中，研究者使用了抗生物素和抗DNP抗体珠进行免疫沉淀。这些抗体珠能够特异性地结合标记聚胺，从而富集被修饰的蛋白质。为了提高检测的灵敏度，研究者对富集的蛋白质进行了胰蛋白酶消化，并通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）进行分析。质谱数据通过MSFragger和FragPipe进行处理，并与小鼠蛋白质数据库进行比对，以确定聚胺化修饰的具体位点。

### 6. 未来研究方向与应用前景

本研究的发现为理解聚胺化在细胞功能调控中的作用提供了重要的基础。未来的研究可以进一步探索聚胺化修饰的具体机制，以及其在不同疾病状态下的作用。例如，聚胺化可能在癌症转移、细胞凋亡和免疫调节中发挥关键作用，因此可以成为新的治疗靶点。此外，研究者还可以开发更高效的聚胺化检测方法，以提高对潜在靶点的识别能力。

总之，本研究通过系统地鉴定TGM2介导的聚胺化靶点，揭示了聚胺化在细胞功能中的重要性。尽管研究方法存在一定的局限性，但其结果为后续研究提供了重要的线索，也为理解聚胺在生物体内复杂功能的机制奠定了基础。未来的研究需要结合更多的实验技术和方法，以进一步揭示聚胺化在生物学中的作用，并探索其在疾病治疗中的应用潜力。