病毒宏基因组测序揭示罕见病原体，提升神经炎症性疾病诊断准确性

本刊推荐：为解决神经炎症性疾病病因不明、诊断困难的问题，研究人员开展了病毒宏基因组测序（mNGS）联合常规检测诊断中枢神经系统（CNS）感染的前瞻性与回顾性队列研究。结果表明，mNGS可检测到常规方法易漏诊的罕见病毒（如Toscana病毒），与PCR联合使用可将总体符合率提升至69%，为全面诊断感染性神经疾病提供了更有效的策略。

　　

在神经内科领域，医生们常常会遇到一些令人困惑的病例：患者出现头痛、发热、意识障碍甚至癫痫等症状，所有临床表现都指向中枢神经系统发生了炎症，但常规检查却无法明确病因。这类神经炎症性疾病可能由感染或自身免疫等原因引起，但高达50%的病例无法确定具体病因。诊断不明确会导致治疗不及时或不恰当，不仅增加患者死亡风险，还会造成医疗资源的浪费。

目前，常规诊断方法主要采用假设驱动的策略，医生根据患者症状和病史，选择特定的病原体进行检测，包括细胞计数与分化分析、细菌培养、特异性聚合酶链反应(PCR)和血清学检测等。这种方法虽然针对性强，但效率较低，且容易漏检罕见、新发或再发的病原体。随着测序技术的发展，宏基因组下一代测序(mNGS)为病原体诊断带来了革命性的变化。这种技术不需要预先假设存在何种病原体，而是通过对样本中所有核酸进行随机扩增和测序，能够同时检测病毒、细菌、真菌和寄生虫等多种病原体。尽管mNGS目前仍存在灵敏度较低、成本较高和分析时间较长等局限性，但其在发现未知病原体方面的优势已经得到初步验证。

为了评估病毒mNGS在神经炎症性疾病诊断中的价值，苏黎世大学医学病毒学研究所的Ian Pichler、Elisabeth Krischer等研究人员开展了一项深入研究，比较了病毒mNGS与传统检测方法在诊断性能上的差异。研究成果发表在《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》上，为感染性神经疾病的诊断提供了新的思路。

研究人员主要通过以下关键技术方法开展研究：他们采用了前瞻性与回顾性相结合的队列设计，收集了2019年10月至2021年9月期间在瑞士三级医院就诊的70例神经炎症性疾病患者的脑脊液(CSF)样本；使用标准化流程进行病毒mNGS分析，包括核酸提取、文库构建和MiSeq平台测序；采用自主研发的生物信息学工具VirMet进行病毒分类鉴定；通过与常规微生物检测方法（包括培养、PCR和血清学检测）的结果进行对比分析，评估mNGS的诊断性能。

患者特征

研究最终纳入了70名参与者，其中56人(80%)为前瞻性纳入，14人(20%)为回顾性分析。回顾性队列包括7例HSV脑炎和7例HIV相关的JCV进行性多灶性白质脑病(PML)患者。所有参与者中位年龄为49岁，59%为男性，12%存在免疫功能低下状态。在两个月随访期内，16%的感染者完全康复，48%出现神经系统后遗症，4例(6%)死亡。

病毒宏基因组NGS分析CSF样本

所有70份CSF样本均进行了病毒mNGS分析。DNA和RNA工作流程分别平均产生约2,500,000和580,000条通过质量过滤的读数。内部质量控制显示CSF样本中人类背景DNA和RNA含量较低。mNGS在51份样本中未检测到病毒，在17份样本中检测到一种病毒，在2份样本中检测到两种或更多病毒。

宏基因组NGS与常规检测的性能比较

基于临床表现、常规诊断和影像学发现，50名患者(71%)被怀疑或确认患有感染性CNS疾病，20名患者(29%)被诊断为自身免疫性疾病。

在20名自身免疫性CNS疾病组参与者中，常规检测在一名参与者中检测到人类疱疹病毒4(EBV)，mNGS在两名参与者中检测到人类pegivirus(HPgV)。

在50名感染性CNS疾病组患者中，通过所有诊断方法在29名个体(58%)中共鉴定出37种病原体。其中32种为病毒，5种为非病毒(3种细菌，1种真菌，1种朊病毒)。13种病原体被常规检测和mNGS共同检测到，15种仅被常规检测发现，9种仅被mNGS发现。

常规检测与mNGS的一致性评估显示，总体符合率(OPA)为59%。当将比较限制在CSF中通过分子方法鉴定的病毒病例时(即mNGS与PCR)，一致性增加到69%。

mNGS未检测到的8种病毒包括：2例蜱传脑炎病毒(TBEV，通过血清学定义但未通过特异性PCR检测)、2例JCV(分别为350和3,000拷贝/mL)，以及各1例HSV-1(227拷贝/mL)、HSV-2(BioFire ME panel阳性)、人类疱疹病毒3(VZV，BioFire ME panel阳性)和EBV(PCR阳性，Ct > 40)。

此外，使用常规检测在其他材料类型中发现了猴痘病毒(MPV)(皮肤损伤拭子)和人类疱疹病毒5(CMV)(血液)。

仅通过常规检测鉴定的非病毒病原体包括：各1例白色念珠菌、肺炎链球菌、无乳链球菌(均在CSF中)和空肠弯曲菌(在粪便中)。此外，根据临床表现和神经影像学发现初步提示朊病毒病克雅病(CJD)，并通过实时震动诱导转化(RT-QuIC)试验确认。

仅通过病毒mNGS检测到的感染性病原体包括：HPgV(4例；31至51 RPM)、Torque Teno病毒(TTV，3例；25至128 RPM)、VZV(1例；5 RPM)和Toscana病毒(TOSV，1例；26 RPM)。

研究结论与讨论

本研究比较了病毒mNGS与常规检测在临床诊断环境中的性能。mNGS仅在CSF样本上进行，而常规检测还包括细胞计数和分化、细菌培养、特异性和多重PCR以及血清学检测，也在CSF以外的样本类型上进行。

在20名自身免疫性CNS疾病组个体中，常规检测发现1例低水平EBV，而mNGS发现2例HPgV。然而，这些发现并未导致临床诊断，因为EBV和HPgV在当时都不被认为是临床症状的致病因素。这些病毒与自身免疫疾病之间是否存在因果关系仍有待解答。

在50名感染性CNS疾病组个体中，病毒mNGS和常规检测在13例和21例中分别报告了相同的阳性和阴性结果。此外，病毒mNGS检测到了9种常规检测未发现的病毒，包括4例HPgV和3例TTV。由于HPgV和TTV通常被认为临床意义不大，因此未包括在标准多重PCR panel或常规诊断检测中。尽管这两种病原体偶尔在CSF中检测到，但它们通常被视为旁观者而非CNS疾病的致病因子。然而，最近的证据表明HPgV与免疫功能低下患者的严重pegivirus相关脑脊髓炎有关。值得注意的是，我们的两名HPgV阳性患者免疫功能低下(一名疑似自身免疫性CNS疾病，一名疑似感染性CNS疾病)。这些发现提出了是否应将HPgV纳入免疫功能低下患者神经系统疾病常规诊断的问题。

对于仅由mNGS检测到的病毒，一例VZV仅产生少量读数，无法通过PCR确认，因此可能代表假阳性；未进行VZV IgM血清学检测。这类事件是mNGS的一个公认局限性，源于环境或试剂污染、数据库限制导致的序列错误分类或索引跳跃。然而，当仅获得少量读数或读数不均匀覆盖基因组时，假阳性主要是一个问题，需要进行确认性PCR。

除了VZV，mNGS还鉴定出了TOSV，该病毒未被常规检测靶向，但随后通过特异性PCR确认。值得注意的是，TOSV在瑞士仅被报道过四次。因此，这个案例突出了无偏mNGS在检测罕见病原体方面的优势。尽管没有针对TOSV的特异性抗病毒药物，但建立明确诊断可提供诊断清晰度、心理保证，并为支持性护理和预后提供指导。

在5例中，未通过mNGS在CSF中检测到的病毒病毒载量较低(两次JCV，一次HSV1、HSV2和EBV)，突显了PCR仍然比mNGS更敏感，因此mNGS可靠性较低。这对于需要治疗的HSV和JCV尤其重要。在2例中，病毒仅通过血清学检测到(TBEV)。另外2例中，病毒在CSF以外的样本类型中发现(血液中的CMV，皮肤损伤拭子中的MPV)。由于mNGS仅在CSF上进行，因此无法检测这些病毒；然而，血液中CMV的检测突显了神经系统疾病的全面诊断有时需要CSF以外的额外样本类型，仅CSF的mNGS并不总是足够的。

此外，MPV阳性患者的神经系统疾病后来被确定为Miller Fisher综合征，最可能与粪便样本中空肠弯曲菌的经典发现相关。MPV是否在引起Miller Fisher综合征中起作用尚不清楚。除了空肠弯曲菌，使用常规方法诊断了两例细菌和一例真菌感染。这突显了我们当前病毒mNGS工作流程的一个局限性，因为非病毒病原体未包括在分析中。

进一步，与PCR检测一样，检测具有短活跃复制阶段的病毒，如黄病毒科(Flaviviridae)，变得具有挑战性。因此，与PCR或mNGS并行运行的间接检测病毒感染的常规检测(例如血清学)可能有益。事实上，在所有样本和病原体中总体符合率为59%，我们发现如果常规检测和mNGS并行运行，可以获得最确凿的结果，这突显了当前达到全面结果所需的诊断复杂性。

尽管我们的研究仅包括70名患者，但我们的发现与先前的研究一致，这些研究表明常规微生物检测本身通常不足以检测所有神经侵袭性病原体。

我们研究的另一个局限性是既未记录诊断时间也未记录常规诊断的成本。因为通常需要多个顺序PCR才能产生阳性结果，预计mNGS可以显著减少周转时间和总成本。前者在神经炎症性疾病的背景下特别有价值，在神经炎症性疾病中，更快的诊断可以促进及时治疗，帮助预防长期神经系统并发症，限制医院传播，并且在阴性结果的情况下，支持停止经验性治疗和避免额外的侵入性诊断程序，例如腰椎穿刺。阴性mNGS结果的重要性得到了先前报告的强调，其中排除病毒感染允许在患有炎症性CNS疾病的患者中开始高剂量免疫抑制。

在我们的实验室，病毒mNGS可以在48小时内提供结果，并且mNGS的成本大约等于五次特异性PCR测试。正式的成本效益分析对于确定在常规临床实践中实施mNGS的经济效益至关重要。

总之，我们得出结论，mNGS有潜力改进常规诊断，尽管与本研究中PCR相比灵敏度较低。补充直接病毒检测的血清学检测仍然是必需的。虽然病原体检测灵敏度仍需要优化，但mNGS独特地提供了在单一检测中无偏检测任何病原体的能力。这对于尚无法通过常规方法检测或可能未被视为疾病病因因此未被搜索的罕见或(再)出现病毒特别有价值。