三唑类杀菌剂丙环唑通过甲状腺激素信号通路(TRβ)诱导斑马鱼幼体心血管毒性的机制研究

本研究针对广泛使用的三唑类杀菌剂丙环唑(MYC)对水生生物心血管发育的潜在危害，通过斑马鱼胚胎模型系统评估其发育毒性与心血管毒性作用，并结合分子对接与激素水平检测揭示其通过竞争性结合甲状腺激素受体β(TRβ)破坏甲状腺激素(TH)稳态，进而导致心血管发育异常的关键机制。补充活性甲状腺激素T3可显著逆转上述毒性效应，为理解农药环境毒理与内分泌干扰作用提供重要理论依据。

　　

在现代农业病虫害防治中，三唑类杀菌剂因其高效广谱的特性而被广泛应用，其中丙环唑(Myclobutanil, MYC)自1989年商业化以来使用量持续增长，已成为谷物、水果和蔬菜真菌病害管理的重要药剂。然而，由于其低生物降解性、高化学稳定性以及在水体和土壤中的持久性残留，MYC在环境介质（如地表水、地下水）和生物体内被频繁检出，甚至存在于婴幼儿食品中，对生态系统和公共健康构成潜在威胁。已有研究表明，MYC对鱼类和甲壳类动物具有发育缺陷、内分泌干扰、神经毒性和肝毒性等多重不良效应，但关于其对心血管系统发育的影响及其机制仍缺乏系统研究。

心血管系统是胚胎发生过程中最早形成并发挥功能的器官系统，对维持机体稳态和系统成熟具有至关重要的作用，因此极易受到环境因素的扰动。近年来，流行病学和实验证据提示三唑类杀菌剂暴露与心血管疾病风险增加相关，例如戊唑醇和苯醚甲环唑可导致大鼠心肌细胞生理功能改变和心脏功能障碍。此外，甲状腺激素(Thyroid Hormone, TH)稳态在脊椎动物心血管发育中扮演关键角色，无论是甲状腺功能亢进还是减退均会引发显著的心血管形态与功能异常。值得注意的是，三唑类杀菌剂已被认定为常见的环境甲状腺干扰物，可能通过破坏TH信号通路间接影响心血管发育。然而，MYC是否通过干扰甲状腺激素通路诱发心血管毒性，其具体分子机制仍有待阐明。

为解决上述问题，研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项研究，以斑马鱼（Danio rerio）为模型，系统评估了MYC对胚胎发育和心血管系统的影响，并深入探讨了其甲状腺激素干扰机制。斑马鱼因其与人类高度保守的心血管发育过程、光学透明特性以及对环境甲状腺干扰物的高度敏感性，成为研究发育毒理和心血管毒理的理想脊椎动物模型。

本研究主要采用以下关键技术方法：以转基因斑马鱼品系（心肌特异性myl7:egfp和血管内皮特异性fli1:egfp）为对象，于受精后4–96小时（hpf）暴露于0.5和1 mg/L MYC；通过显微镜成像和EthoVision?XT软件分析发育表型（存活率、孵化率、畸形率、自发运动、心率等）和心血管形态功能参数（心脏房室体积、心室缩短分数、BA-SV距离、节间血管ISV完成率等）；使用商业ELISA试剂盒检测甲状腺激素（TSH、T4、T3）含量；通过分子对接（AutoDock 4.2.6）模拟MYC与斑马鱼甲状腺激素受体β（TRβ）的结合模式；采用qPCR分析心血管发育基因（如nkx2.5、hand2、vmhc、gata4、vegfa、cdh5等）及下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT axis）相关基因（如tshβ、crh、dio1/2/3、tg、tpo、trα/β等）的表达变化。

3.1. Effect of MYC on embryonic development in zebrafish larvae

研究结果显示，1 mg/L MYC暴露显著降低斑马鱼幼体的存活率和孵化率，提高畸形率和24 hpf时的自发运动频率，并导致48 hpf时心率显著下降（心动过缓），但对体长无显著影响。这些结果表明MYC对早期发育具有多方面的毒性效应。

3.2. Effect of MYC on cardiac development in zebrafish larvae

在myl7:egfp转基因鱼中，MYC引起心脏结构异常，表现为心脏伸长、房室重叠减少、BA-SV距离增加，以及心室体积（收缩期和舒张期）显著减小，心室缩短分数（FS）下降，提示MYC导致心脏形态和功能缺陷。

3.3. Effects of MYC on vascular development in zebrafish larvae

fli1:egfp转基因鱼实验表明，MYC处理组血管荧光信号减弱，ISV完成率、ISV距离和ISV长度均显著降低，说明MYC干扰血管正常生成和模式形成。

3.4. Effects of MYC on the transcription of cardiovascular-related genes

分子水平上，MYC抑制心脏关键基因（hand2、nkx2.5、vmhc、gata4）的表达，同时下调血管生成正调控因子vegfa和cdh5，上调vegfc和dll4，进一步从基因表达层面验证了其心血管毒性。

3.5. Effects of MYC on levels of THs and HPT axis related genes

MYC暴露导致甲状腺激素稳态紊乱：TSH和T4含量及T4/T3比值显著上升，而T3水平下降；HPT轴相关基因出现广泛失调，包括tshβ、crh、tg、nis、tpo上调，dio1、dio2、ttr下调，dio3上调，且trβ（而非trα）表达显著抑制。

3.6. MYC-TRβ interaction analyzed by molecular docking analysis

分子对接结果表明，MYC能够以高亲和力（结合能为-10.191 kcal/mol）结合到斑马鱼TRβ的配体结合口袋中，与关键残基（如ASN 265）发生相互作用，竞争性抑制T3与受体的结合。

3.7. Effect of T3 on MYC-induced cardiovascular toxicity in zebrafish larvae

外源性补充T3可显著逆转MYC引起的发育毒性、心血管结构功能异常、TH水平紊乱及相关基因表达失调，证实甲状腺激素信号通路是MYC心血管毒性的关键机制。

本研究通过多维度实验证明，MYC可通过直接结合并干扰TRβ功能，破坏甲状腺激素稳态，进而引起斑马鱼心血管发育异常。这一发现不仅深化了对三唑类杀菌剂环境毒理机制的理解，也为评估其生态与健康风险提供了重要依据。尽管当前实验浓度高于环境实际检出水平，但其揭示的甲状腺干扰机制具有普遍毒理学意义。未来需在更接近环境现实的暴露场景下开展慢性多世代研究，并结合体外结合实验（如SPR、ITC）、报告基因检测及分子动力学模拟进一步验证MYC与TRβ的互作模式。该研究为探索农药类内分泌干扰物的心血管毒性机制提供了新模式，对公共安全和环境政策制定具有重要参考价值。