重组谷氨酰胺合成酶高效减排畜禽粪污氨气并促进氮素氨基酸转化提升有机肥品质

本研究针对畜禽粪污储存过程中NH3和N2O排放造成的氮素损失与环境污染问题，通过异源表达枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺合成酶(GS)，开发了一种新型酶处理技术。研究发现添加1-5%重组GS可使NH3排放减少19.57-45.91%，N2O排放降低18.29-33.59%，同时显著提升谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)含量，有效改善粪污肥料化价值，为畜禽粪污资源化利用提供了创新解决方案。

　　

随着全球肉类需求预计到2050年增长73%，集约化养殖产生的畜禽粪污已成为严峻的环境挑战。液态粪污在储存过程中会释放大量氨气(NH₃)和氧化亚氮(N₂O)，不仅造成氮素损失达30%以上，还贡献温室效应、酸雨形成和大气颗粒物污染。其中NH₃排放占养殖场臭气的90%，严重制约畜牧业可持续发展。传统生物脱氮技术主要通过硝化和反硝化作用将氮转化为氮气(N₂)，虽能减少NH₃排放，但导致氮资源彻底损失，且反硝化过程可能产生更多N₂O，需大量能耗进行曝气。微生物同化作用将无机氮转化为有机氮，成为更具前景的氮保留策略，其中谷氨酰胺合成酶(GS)催化NH₄⁺同化为谷氨酰胺(Gln)，是细菌氮同化的核心酶。然而，在高铵条件下，枯草芽孢杆菌中的glnA基因转录受到反馈抑制，限制了其应用潜力。

本研究由四川农业大学资源学院Lin Shaowenlan等研究人员完成，发表于《Engineering Microbiology》。研究团队从166株益生芽孢杆菌中筛选出9株氨氮利用率高于65%的菌株，其中枯草芽孢杆菌M246利用率超过80%。通过基因组测序发现这些菌株缺乏关键硝化基因(如amoCAB)，表明NH₄⁺主要通过GS/GOGAT途径同化。研究人员克服glnA在高NH₄⁺浓度(100 mM)下的转录抑制，在毕赤酵母中异源表达glnA基因，并将重组GS应用于液态猪粪处理，系统评估了其减排效果和氮素转化途径。

研究采用的主要技术方法包括：从四川规模化养殖场采集样本分离芽孢杆菌；通过Illumina PE150系统进行第二代测序和基因组注释；绝对定量RT-PCR分析glnA转录水平；利用pPIC9K载体在毕赤酵母GS115中异源表达glnA；设置对照组(CK)、1-5% GS处理组和M246处理组进行液态粪污处理实验；采用气相色谱测定NH₃和N₂O排放；三维荧光光谱分析溶解性有机质；液相色谱-质谱联用技术测定氨基酸含量；16S rRNA基因高通量测序分析微生物群落结构。

3.1. 芽孢杆菌的分离与鉴定

从各类样品中共分离纯化出271株芽孢杆菌，其中166株被鉴定为益生芽孢杆菌，包括113株枯草芽孢杆菌、18株地衣芽孢杆菌、31株贝莱斯芽孢杆菌和4株短小芽孢杆菌。芽孢杆菌具有高蛋白分泌能力、底物适应性广、耐极端pH和温度等优势，在改善养殖环境方面具有广泛应用前景。

3.2. 芽孢杆菌的第二代测序

对9株高氨氮利用率芽孢杆菌进行基因组测序，通过KEGG、eggNOG、GO和CAZymes数据库注释分析。预测的氮代谢途径包括异化/同化硝酸盐还原、反硝化、硝化和铵同化。研究发现这些菌株缺乏amoCAB和hao等硝化关键基因，反硝化过程因缺少nirK/nirS而不完整，但异化/同化硝酸盐还原途径相关基因(narGHI、nirBD、nasAB)齐全。更重要的是，检测到glnA(GS)和gltB(GOGAT)基因，而未发现gudB(GDH)基因，表明GS/GOGAT循环是这些菌株铵同化的主要途径。

3.3. glnA基因在不同NH₄⁺浓度处理下的转录水平

绝对定量RT-PCR分析显示，glnA拷贝数随NH₄⁺浓度增加而上升，在80 mM时达到峰值(7.95×10⁶ copies/mL)，但在100 mM时显著下降(3.53×10⁵ copies/mL)，表明高铵条件下GS可能形成反馈抑制形式(FBI-GS)，与全局氮调节因子TnrA结合抑制glnA转录。

3.4. 重组菌株GS115-pPIC9K-glnA的构建

成功从M246菌株中PCR扩增出glnA基因，构建表达载体pPIC9K-glnA，经限制性内切酶消化和测序验证。SDS-PAGE分析显示重组毕赤酵母诱导上清液中存在预期大小的特异蛋白条带，表明目标蛋白正确表达。酶活分析显示诱导5天后GS活性达到峰值。

3.5. GS在液态猪粪中的应用

3.5.1. 液态粪污中NH₃和N₂O的排放

所有处理组NH₃排放均在1-3天达到峰值后下降。GS处理组NH₃排放始终低于M246和CK组，峰值浓度分别为50.32 mg/L(1% GS)、39.57 mg/L(2% GS)和30.98 mg/L(5% GS)，较CK组(71.62 mg/L)分别降低19.57%、35.10%和45.91%，而M246组仅降低6.45%。N₂O排放也呈现类似趋势，GS处理组累积排放较CK组降低18.29-33.59%，M246组降低7.77%。

3.5.2. NH₄⁺-N、NO₃-N、TN和氮平衡的变化

GS处理组在所有采样日均产生较低水平的NH₄⁺-N(287.03-571.00 mg/L)，且呈现剂量依赖性下降。TN浓度在所有处理组均呈下降趋势，但GS处理组TN浓度显著高于CK组和M246组，表明GS添加增强了氮保留。氮平衡分析显示1% GS处理在氮保留和气体氮损失间提供了最佳平衡，固定氮比例达75.70-81.47%，显著高于CK组(67.29%)和M246组(70.69%)。

3.5.3. 氮转化功能基因的丰度

glnA基因丰度在所有处理组中从第1天到第9天均增加，但GS处理组在第1天显著低于M246和CK组，可能是外源GS促进NH₄⁺快速转化为Gln，引起细胞内Gln积累反馈抑制glnA转录。gdh基因丰度显著高于glnA，表明gdh也是液态粪污中氨同化的主要途径。amoA基因丰度随时间推移而下降，GS处理组显著低于CK和M246组，表明外源GS通过同化NH₄⁺降低NH₃有效性，抑制amoA表达。norB基因丰度在GS处理组也显著低于CK和M246组，可能与减少的NO可用性有关。

3.5.4. 液态粪污中的溶解性有机质

平行因子分析(PARAFAC)鉴定出两个荧光组分：C1(Em/Ex=350/280 nm，色氨酸类物质)和C2(Em/Ex=440/250 nm和440/340 nm，腐殖质类物质)。第1天所有处理组在C1峰显示较高荧光强度，M246处理组蛋白类峰强度最高。GS处理组在第1天显示最高的C2荧光强度，表明其能够快速将DOM转化为稳定的类腐殖质，减少臭味气体和温室气体排放。第9天，GS处理组显示较低的C1荧光强度和较高的C2荧光强度，表明GS通过调节氮代谢和微生物活性加速腐殖化过程。

3.5.5. 液态粪污中氨基酸的检测与浓度

第1天，GS和M246处理均增加了所有三类功能氨基酸的浓度。GS添加显著提高了Gln和Glu水平，Gln从CK组的0.13±0.004 μmol/L升至0.19±0.027 μmol/L，Glu从6.23±0.16 μmol/L升至11.96±2.17 μmol/L。M246处理导致Asp和Ala水平急剧上升(37.84±3.368 μmol/L和123.75±9.718 μmol/L)。在耐盐氨基酸中，GS添加显著增加了Met、Thr、Lys、Phe和Tyr的浓度。第9天，所有氨基酸浓度随着微生物代谢的进行而显著下降，但GS组仍保持较高水平的氨基酸，表明GS稳定了氮代谢。

3.5.6. 驱动氮保留和损失的微生物类群

厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度最高(19.35-47.55%)，在CK组(34.78%)和M246添加组(45.74%)中占主导。GS处理组中螺旋体门(Spirochaetota)显著富集，第1天RA达到37.86%。在属水平上，CK组中Advenella在第3天(41.75%)和第9天(41.61%)显著增加，但在GS和M246添加组中始终较低。LEfSe分析将Advenella确定为CK组的优势生物标志物属。Sphaerochaeta被LEfSe确定为GS组的优势生物标志物，丰度显著高于CK和M246组。人工引入的Bacillus仅在M246处理组中检测到，且随时间推移逐渐下降。冗余分析(RDA)显示，第1天Gln、NH₃、N₂O和norB等环境因子与群落变异显著相关；第3天glnA和NH₄⁺-N成为主要驱动因子；第9天Glu、Gln、TN和氨同化基因(glnA、gdh)占主导地位。

3.5.7. GS驱动排放 mitigation 和氮保留的潜在机制

GS处理中，外源GS提供了直接催化途径，将NH₄⁺高效同化为Gln、Glu和其他氨基酸，将无机氮从挥发或硝化-反硝化途径转向有机氮库。M246处理则主要依靠内源glnA基因表达和与周围微生物群落的相互作用实现间接铵同化和氮保留。两种处理均能富集有益类群(如Acholeplasma和Sedimentibacter)同时抑制反硝化菌(如Advenella)。但外源GS比 Bacillus M246发挥更直接有效的影响，因其可在细胞外起作用，允许更直接高效地将无机氮转化为氨基酸。

研究结论表明，重组谷氨酰胺合成酶技术能有效减少畜禽粪污中的气体排放，增强氮素保留，促进铵态氮向氨基酸转化，并改善液态粪污的生物肥料品质。通过异源表达技术克服了天然菌株在高铵环境下的转录抑制问题，外源添加GS酶可直接在粪污环境中催化铵态氮固定，避免了活菌应用面临的生存竞争和环境适应问题。该研究不仅为畜禽粪污处理提供了新型酶处理技术，也为农业废弃物资源化利用和绿色农业发展提供了创新思路，具有重要的环境意义和应用价值。