多样化体外肝模型揭示四溴双酚A的全面生物转化路径及其环境健康意义

本刊推荐：为解决四溴双酚A（TBBPA）在人体肝脏中代谢路径不清、单一模型预测局限的问题，研究人员利用人肝微粒体（HLM）、人肝癌细胞（HepG2）和人正常肝细胞（MIHA）三种体外模型，系统比较了TBBPA的代谢差异。研究发现三种模型代谢程度和产物类型显著不同，共鉴定出21种代谢物，首次发现TBBPA单葡萄糖苷单葡萄糖醛酸苷新代谢物，并揭示了包括葡萄糖醛酸化、硫酸化、脱溴等复杂转化通路，为更准确评估TBBPA的环境归趋和健康风险提供了重要依据。

　　

四溴双酚A（Tetrabromobisphenol A, TBBPA）作为一种广泛使用的溴系阻燃剂，存在于电子产品、塑料及日常消费品中。由于其环境持久性和生物累积性，TBBPA已在空气、水体、土壤乃至生物体和人体中被广泛检出。更值得关注的是，TBBPA在结构上与甲状腺激素和类固醇激素相似，可干扰内分泌和神经系统功能，甚至在环境相关浓度下就可能导致肝功能异常。近年研究还表明，长期暴露于TBBPA可能引发糖耐量受损和胰岛素抵抗，对代谢健康构成潜在威胁。

尽管以往研究通过动物实验和人体志愿者的粪便与尿液分析，发现TBBPA可被迅速吸收并主要转化为葡萄糖醛酸化和硫酸化结合物，但这些体内研究难以区分消化道和肝脏在TBBPA生物转化过程中的具体贡献。肝脏作为人体代谢外源化合物的核心器官，其酶系统如细胞色素P450（CYPs）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）和磺基转移酶（SULTs）等在化合物的I相和II相代谢中起关键作用，然而TBBPA在肝脏中的具体代谢路径、产物形成与转化机制仍不明确。

此外，目前常用的体外肝模型，如人肝微粒体（HLM）和人肝癌细胞（HepG2），虽被广泛用于代谢研究，但尚未形成标准化模型体系，不同模型之间的代谢差异亦常被忽视，导致对化合物代谢路径的预测不一致、不完整，阻碍了体外数据向人体实际情况的外推。为此，本研究选取HLM、HepG2细胞和人正常肝细胞（MIHA）三种体外肝模型，系统开展了TBBPA的代谢比较研究，旨在揭示不同模型下的代谢差异，并通过模型整合构建更全面的TBBPA生物转化通路，为其环境归趋和健康风险评价提供科学依据。该研究发表于《Engineering Microbiology》。

本研究主要采用了体外代谢孵育结合高分辨质谱非靶向筛查的技术策略。首先，在HLM模型中设置了I相、II相以及I+II相共同作用的孵育体系，并加入相应辅因子如NADPH和UDPGA以激活酶反应；在HepG2与MIHA细胞模型中，则通过细胞培养与暴露实验，在不同时间点取样分析。样品经固相萃取净化后，采用液相色谱-三重四极杆质谱（LC-MS/MS）进行定量分析，并利用超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）进行非靶向代谢物鉴定。通过对比不同模型中TBBPA的代谢动力学及代谢产物，揭示其转化路径与酶机制差异。

3.1. Content variations of TBBPA in HLM, HepG2 cell, and MIHA cell systems

通过定量分析发现，三种模型对TBBPA的代谢程度存在显著差异。在HLM系统中，TBBPA在90分钟内被大量代谢，其中I+II相代谢组中92.4%的TBBPA被转化，且II相代谢占主导地位；而在HepG2细胞中，48小时内仅有13.6%的TBBPA被代谢；MIHA细胞则表现出最高的代谢能力，98.4%的TBBPA被转化。细胞吸收实验表明，TBBPA可快速进入MIHA细胞并在细胞内被代谢，而培养基及细胞分泌物对TBBPA代谢的贡献可忽略。这些结果说明，代谢效率高低与模型类型密切相关，其中MIHA细胞与HLM模型代谢能力相当，远高于HepG2细胞。

3.2. Metabolites in three in vitro liver incubation systems

通过非靶向代谢组学分析，共鉴定出21种TBBPA代谢物，包括7种葡萄糖醛酸化产物、5种硫酸化产物、4种糖基化产物、2种甲基化产物、5种脱溴产物等。三种模型所产生的代谢物存在明显差异：HLM系统中检出7种代谢物，以TBBPA双葡萄糖醛酸苷（TBBPA DGn）为主；HepG2细胞中检出9种代谢物，以TBBPA单硫酸酯（TBBPA MS）为主；而MIHA细胞中检出16种代谢物，类型最为丰富，并以TBBPA单葡萄糖醛酸苷（TBBPA MGn）为主要产物。值得注意的是，本研究首次在MIHA细胞中发现了TBBPA单葡萄糖苷单葡萄糖醛酸苷（TBBPA MG MGn），提示糖基化代谢的存在。通过模型间对比发现，没有任何一种代谢物同时存在于所有三种模型中，仅部分代谢物如M???、M???等为两个模型所共有。这一结果突显了单一模型在代谢研究中的局限性，而多模型整合则可更全面地反映TBBPA在人体肝脏中的实际代谢情况。

3.3. Possible metabolic pathways

基于代谢物的出现时序与含量变化，研究推断出TBBPA的可能代谢路径，包括葡萄糖醛酸化与去葡萄糖醛酸化、糖基化、硫酸化、甲基化、脱溴以及耦合消除反应等。在MIHA细胞中，TBBPA MGn较早出现，其后才生成TBBPA DGn，表明其葡萄糖醛酸化过程为分步进行；而在HLM模型中，TBBPA DGn迅速生成且含量远高于TBBPA MGn，提示可能存在一步双葡萄糖醛酸化机制。此外，TBBPA DGn在样品储存过程中易发生非酶去葡萄糖醛酸化，生成TBBPA MGn，表明该转化反应在体内外均可能发生。其他路径如TBBPA经甲基化生成TBBPA MME，再进一步葡萄糖醛酸化生成TBBPA MGn MME；或经脱溴生成三溴BPA（TriBBPA），再硫酸化生成TriBBPA MS等，均显示出代谢网络的复杂性。特别值得注意的是，本研究还推断出TBBPA可通过耦合反应生成含三个苯环的代谢物M???，并进一步通过取代反应产生单苯环类代谢物，如M???、M???等，拓展了对TBBPA代谢化学多样性的认识。

本研究通过三种体外肝模型的比较与整合，系统揭示了TBBPA的复杂生物转化网络，表明不同模型因酶表达与活性的差异而表现出 distinct 的代谢特征与产物谱。其中，MIHA细胞模型代谢能力最强、产物类型最丰富，更接近体内肝脏代谢的真实情况；HLM模型虽代谢速率极高，但产物类型较为单一；HepG2细胞则代谢能力较弱，且缺乏葡萄糖醛酸化产物。这一发现提示，在未来的化合物代谢与毒性评价中，应避免依赖单一体外模型，而需结合多种模型以更全面、准确地预测其在人体中的代谢行为与环境健康风险。

此外，本研究首次报道的TBBPA糖基化代谢路径以及在MIHA细胞中发现的新型代谢物TBBPA MG MGn，为TBBPA的生物转化机制提供了新视角。多种低丰度代谢物如甲基化、脱溴及单环类产物的鉴定，也提示我们在环境与健康风险评价中，不应只关注母体化合物，还需充分考虑其转化产物的潜在毒性、环境行为与生物累积性。未来需结合计算毒理学平台（如ToxACoL、ADMETlab等）对这些代谢物的毒性进行预测与验证，以更科学地评估TBBPA及其代谢物对人体健康的综合影响。

综上所述，本研究通过多维度的体外代谢研究策略，不仅深化了对TBBPA生物转化途径的理解，也为相关污染物的风险评估提供了方法学参考，同时推动了体外模型在环境毒理学与健康研究中的更合理应用。