奶酪乳清中试规模生产聚羟基脂肪酸酯：评估混合微生物培养物的作用

本研究针对传统塑料污染和聚羟基脂肪酸酯(PHA)生产成本高的问题，利用奶酪乳清作为废弃原料，通过中试规模的三级生物反应器系统，成功实现了从挥发性脂肪酸(VFA)到PHA的高效转化。研究通过优化有机负荷率(OLR)和固体停留时间(SRT)等关键参数，使PHA积累量达到0.79 gPHA gDryBiomass-1，并结合基因组导向的宏基因组学技术揭示了新型候选糖菌门(Candidatus Saccharibacteria)在酸发酵过程中的主导作用。该研究为废弃资源高值化利用和可降解生物塑料的规模化生产提供了重要技术支撑。

　　

随着全球塑料污染问题日益严重，寻找传统塑料的可替代品已成为当务之急。聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为一种由微生物合成的线性聚酯，具有与常规塑料相似的材料特性，且能够完全生物降解，因此被视为理想的环保替代材料。然而，当前PHA生产成本居高不下，主要源于昂贵的基础培养基、较低的产率以及复杂的提取工艺，这严重制约了其大规模商业化应用。

为了突破这些瓶颈，研究人员开始将目光投向废弃资源利用和混合微生物培养(MMC)技术。奶酪乳清作为奶酪生产过程中的主要副产物，含有高达90%的乳糖成分，具有有机负荷高(46-68 gCOD L^--1)、易发酵等特点，是生产挥发性脂肪酸(VFA)的理想底物。而VFA正是微生物合成PHA的重要前体物质。采用混合微生物培养体系不仅无需严格灭菌条件，还能充分利用微生物群落间的协同作用，显著降低生产成本。

在此背景下，Nuria Otero-Logilde等研究人员在《Environmental Technology》上发表了他们的最新研究成果。该研究创新性地构建了一个包含三级生物反应器的中试规模生产系统，全面评估了有机负荷率(OLR)和固体停留时间(SRT)对VFA和PHA产量的影响，并采用基因组导向的宏基因组学技术深入解析了各阶段的微生物群落结构特征。

研究人员采用了一套完整的技术方法体系：首先建立了包含三个序批式反应器和两个储存罐的中试平台，系统运行温度控制在30°C，通过可编程控制器自动调控运行周期和参数监测；其次，通过对奶酪乳清原料的特性分析，确定了其乳糖含量(81-100% gCOD_Lactose gCOD_Total^-1)和营养成分特征；在微生物群落分析方面，采用酚/氯仿提取法进行DNA分离，使用Illumina Novaseq 6000平台进行宏基因组测序(双端150bp)，并通过宏基因组组装基因组(MAGs)技术获得中高质量基因组；此外，还定期对反应器中的总悬浮固体(TSS)、挥发性悬浮固体(VSS)、铵盐和磷酸盐浓度等参数进行监测，采用高效液相色谱法(HPLC)测定有机酸和乳糖浓度，通过气相色谱法检测PHA含量。

3.1. 酸发酵反应器性能

研究人员在酸发酵反应器中测试了多种操作条件，评估了OLR(3.5-6.0 gCOD L^-1 d^-1)和SRT(5-10天)对酸发酵过程的影响。研究发现在所有条件下，酸发酵度(AD)介于69%-84% gCOD_effluent gCOD_initial^-1之间，其中条件1A(OLR 3.5 gCOD L^-1 d^-1，SRT 10天)表现最佳，达到84±6%的最高酸发酵度。提高OLR虽然增加了VFA生产率(从2.7提高到3.8 g_VFA L^-1 d^-1)，但却降低了酸发酵效率，表明存在底物抑制或微生物代谢途径转变的可能。

在酸组成方面，研究观察到随着操作条件的变化，乙酸、丁酸、丙酸、戊酸和乳酸的相对比例发生显著变化。在SRT较长的条件下(10天)，丁酸成为主要产物(40-46%)，而较短SRT(5天)则促进乙酸生成(41-55%)。特别值得注意的是，在高OLR条件(6.0 gCOD L^-1 d^-1)下，乳酸积累明显，表明发酵过程不完全。

3.2. PHA生产工艺优化

在PHA富集反应器中，研究人员评估了三种不同的OLR(0.7-1.5 gCOD L^-1 d^-1)和SRT(4-6天)组合条件。结果表明PHA产率在0.27-0.33 mmolC_PHA mmolC_VFA^-1之间， feast阶段结束时PHA积累量为19.5-22.9% mg_PHA mg_DryBiomass^-1。其中条件II(OLR 1.1 gCOD L^-1 d^-1，SRT 4天)表现最佳，且 feast/famine(F/F)比率保持在0.2以下，确保了富集培养物的稳定性。

在分批补料试验中，FB3条件获得了79% g_PHA g_DryBiomass^-1的最高PHA积累量，总过程产率达到0.38 mmolC_PHA gCOD_S^-1。PHA的单体组成以羟基丁酸(HB)为主(69-86%)，这与酸发酵反应器中乙酸和丁酸的优势地位相一致。羟基戊酸(HV)的比例(13-31%)则与丙酸和戊酸的供应量直接相关。

3.3. 微生物群落结构与功能解析

通过基因组导向的宏基因组学分析，研究共获得了509个MAGs，其中311个达到中高质量标准。酸发酵反应器中的微生物群落以候选糖菌门(Candidatus Saccharibacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)为主，其中候选糖菌门的优势地位(特别是Candidatus Saccharibacteria sp. 385)在酸发酵环境中罕见报道。

研究发现在SRT为10天的条件下，拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著增加，其中普雷沃氏菌属(Prevotella)在某些样品中达到24%的丰度。马格斯菲菌(Megasphaera cerevisiae)被鉴定为丁酸生产的关键菌种，其在PILAC2和PILAC5样品中的相对丰度分别达到12.2%和11.8%。

在PHA富集反应器中，微生物群落结构发生显著转变，以变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主。红环菌科(Rhodocyclaceae)在PILEN5、PILEN7和PILEN8样品中表现出较高丰度(10.0-36.4%)，而索氏菌属(Thauera)在PILEN3中达到7.8%的丰度。值得注意的是，塑料积聚菌(Plasticicumulans acidivorans)也被检测到，这是一种公认的PHA积累菌。

功能分析揭示了两个反应器中微生物代谢功能的明显分化。酸发酵反应器中的MAGs编码大量β-半乳糖苷酶(GH1、GH2、GH16家族)，负责乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，随后通过EMP、ED和PP等糖酵解途径进行降解。富集反应器中的MAGs则富含β-氧化和脂肪酸合成途径相关基因，负责将VFA转化为PHA前体。

特别有趣的是，研究发现富集反应器中存在大量不编码PHA合酶但具有脂肪酸代谢能力的微生物(占124/311个MAGs)，这些菌可能通过产生和输出3HA来支持PHA积累菌的生长，或在饥饿阶段利用PHA单体，体现了微生物群落间的潜在协同关系。

该研究成功验证了以奶酪乳清为原料生产中试规模PHA的可行性，最高积累量达到79% g_PHA g_DryBiomass^-1。通过宏基因组分析不仅揭示了候选糖菌门在酸发酵过程中的关键作用，还发现了富集反应器中存在大量非PHA积累菌，这些菌可能通过代谢互作支持PHA积累菌的生长。

研究的重要意义在于为废弃乳清资源的高值化利用提供了完整的技术方案，通过优化OLR和SRT等操作参数，实现了VFA和PHA的高效生产。微生物群落结构的深入解析为理解混合培养体系中微生物间的协同作用提供了新视角，特别是非PHA积累菌的功能研究为未来微生物群落工程优化提供了重要思路。

这项研究不仅推动了PHA生产工艺向低成本、可持续方向发展，也为工业规模实施废弃资源到生物聚合物的转化过程提供了坚实的技术基础和理论指导，对促进循环经济和减少塑料污染具有重要的实践意义。