通过滴灌施用的耐盐PGPB通过改变土壤细菌群落来提高作物产量和品质

《Engineering》：Halotolerant PGPB Delivered by Drip Irrigation Improve Crop Yield and Quality Through Changes in the Soil Bacterial Community

通过滴灌系统在盐碱土中施用嗜盐芽孢杆菌（PGPB）可有效改善无花果的产量和品质，同时促进土壤养分循环和微生物群落多样性，并增强植物抗氧化酶活性。

　　全球盐碱地的总面积估计达到9.5×10^8公顷，占全球可耕地面积的20%。高盐碱度会对植物造成离子毒性、渗透胁迫等问题，进而导致营养失衡、激素紊乱和氧化损伤，这些因素严重限制了作物的产量。目前，缓解土壤盐碱化的方法主要包括物理和化学两种。物理方法包括引入外源土壤改良技术、铺设沙土以及开挖或盲沟排水等，而化学方法则包括使用钙、碱性物质、有机物和矿物资源改良剂等。然而，这些方法在实际应用中常常面临成本高、工程量大和环境不友好等限制。

近年来，利用微生物制剂改善盐碱土壤并减轻作物盐胁迫已成为农业研究的重要方向。植物生长促进细菌（PGPB）是一类能够定植于植物根部，促进作物生长的有益微生物。但只有那些具有抗逆能力的微生物才能通过多种机制促进植物生长。耐盐微生物（Halotolerant PGPB）能够在盐胁迫条件下生存和繁殖，并且相较于非耐盐细菌，在提高植物耐盐性方面更为有效。一般来说，耐盐微生物能够通过改善植物水分运输、调节植物激素状态、诱导植物系统抗性以及增加土壤中营养物质的可利用性来促进作物的发展。然而，PGPB能否发挥其作用，很大程度上取决于其在植物根际环境中的存活和繁殖能力，而这又受到应用方式的影响。现有的应用方式包括种子接种、植物体表施用和土壤基部施用，这些方法通常只在作物生长周期中使用一次。

滴灌技术能够均匀而缓慢地将水分和养分输送到作物根部附近的土壤中，从而最大化植物的生长和产量。我们假设，将耐盐微生物与水肥溶液一同通过滴灌系统施用于作物根际，能够提高微生物的存活率，并促进植物的生长。本研究评估了滴灌耐盐微生物对盐碱土壤中作物生长和土壤肥力的潜在效果，并进一步探讨了其对根际微生物群落组成、多样性和功能潜力的影响。此外，我们还引入了微生物群落共现网络的分析方法，以研究微生物群落内部的相互作用关系。这种网络分析方法可以帮助理解微生物群落的功能特性，从而为改善盐碱土壤和缓解植物盐胁迫提供理论依据。

本研究的实验地点位于中国新疆维吾尔自治区的农业水资源管理与灌溉实验站，实验时间从2020年至2022年。该地区具有典型的大陆干旱气候，年平均日照时长为2865小时，年平均气温为10.7℃，年降水量仅为67毫米，而蒸发量高达2110毫米。土壤类型为沙质土壤，0–40厘米深度的土壤pH值为8.9，电导率（EC）为873 μs·cm^-1，总盐碱度为4.3 g·kg^-1，可利用氮（AN）为15.1 mg·kg^-1，可利用磷（AP）为9.4 mg·kg^-1，可利用钾（AK）为68.4 mg·kg^-1，有机质（OM）含量为3.81 mg·kg^-1，土壤容重为1.41 g·cm^-3，田间持水量为23.6%。实验中使用的PGPB包括枯草芽孢杆菌（BS）、荧光假单胞菌（PF）、苏云金芽孢杆菌（BT）、巨大芽孢杆菌（BMe）、短芽孢杆菌（BL）、蜡样芽孢杆菌（BC）和粘质芽孢杆菌（BM），这些微生物由北京强兴生物科技有限公司生产，其活性菌落数量大于5.0×10^8 CFU·g^-1。实验设置中，未添加微生物的植株作为对照组（CK），每个处理组设置六次重复，每个实验区（2.8 m × 5.0 m）包含30株红枣树。整个生长周期分为五个阶段，包括枝条生长期（Tw）、开花期（FL）、果实膨大期（FE）、成熟期（WR）和完全成熟期（FR）。整个生长周期内进行了16次灌溉，其中在枝条生长期后期，养分和PGPB的施用交替进行，共进行了7次养分施用和7次PGPB施用（见附录A的表S1）。

在滴灌系统中，50毫升的耐盐PGPB以10^8 CFU·mL^-1的浓度溶解于水中，并通过滴灌系统输送至红枣根部。每块实验区的滴灌头均安装了文丘里注射器，用于将耐盐PGPB均匀施用于根际环境。红枣树以80厘米窄行和200厘米宽行种植，株距为100厘米。滴灌系统布置在红枣树两侧，距离根部约20厘米，其流量为3.0 L·h^-1。整个生长周期内总灌溉量为8210 m^3·ha^-1，其中包括318 kg·ha^-1的氮肥（N）、180 kg·ha^-1的磷肥（P2O5）和359 kg·ha^-1的钾肥（K2O）（见附录A的表S2）。对照组（CK）接收与处理组相同的水分和养分，但不添加微生物。

在实验过程中，我们对红枣根际土壤进行了采样，并测定了其化学性质。采样时间设定在耐盐PGPB施用后的第五天，整个实验期间共进行了四次采样，分别对应红枣的开花期（FL）、果实膨大期（FE）、成熟期（WR）和完全成熟期（FR）。采样后的土壤样本经过1毫米筛分，以去除大颗粒。土壤pH值通过复合电极（InPro2000；Mettler-Toledo，瑞士）测定，使用土壤与水的比例为1:2.5。土壤电导率（EC）则通过电导率计（DDS-11A；上海大普仪器有限公司，中国）测定。部分土壤样本在低温下运输至实验室后，被分为两部分：一部分自然风干并通过2毫米筛分，用于测定土壤化学性质；另一部分则在4℃条件下保存，用于测定土壤酶活性和提取DNA以进行16S rRNA基因扩增子测序。

我们选择了对盐碱土壤和作物表现具有积极影响的前三种PGPB处理方式，即BL、BC和BM，进行基因组DNA提取。DNA提取过程按照MP FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals，美国）的制造商说明进行。为了分析根际微生物群落的结构，我们对16S rRNA基因的V4区进行了扩增子测序，使用引物对338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳后，选取400–450 bp之间的明亮主带进行等密度混合，并使用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，德国）进行纯化。随后，使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina，美国）构建测序文库，并添加索引代码。最终，通过Illumina HiSeq 2500平台（Majorbio，中国）进行测序，共获得1,010,634条有效的16S rRNA基因序列，每条序列的平均数量为19,504–72,708。为了提高测序数据的可靠性，我们对每条序列进行了随机抽样，使其数量统一为19,504条。通过UPARSE软件，将这些序列聚类为3795个操作分类单元（OTUs），聚类相似度为97%。

在植物抗氧化酶活性、产量和品质的测定方面，我们从每株红枣树的东、南、西、北四个方向各选取五颗果实进行分析。每组处理设置五次重复。新鲜叶片（0.15克）在正常生理盐水中（1.35毫升）进行匀浆并冷却至4℃。匀浆液在4℃下以3500 r·min^-1的速度离心10分钟，上清液用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。SOD活性采用羟胺法测定，POD活性采用紫外–可见分光光度法测定，CAT活性则采用钼酸铵法测定。

在土壤肥力和盐碱度的测定方面，我们观察到滴灌耐盐PGPB对土壤pH值和EC值有显著影响。在开花期（FL）阶段，滴灌耐盐PGPB使土壤pH值和EC值分别降低了0.5%–3.4%和0.9%–21.3%。在果实膨大期（FE）阶段，土壤pH值和EC值分别降低了1.8%–6.7%和0.8%–22.9%。在成熟期（WR）阶段，土壤pH值和EC值分别降低了1.3%–8.8%和5.3%–26.3%。而在完全成熟期（FR）阶段，土壤pH值和EC值分别降低了0.8%–9.2%和0.2%–15.1%。在不同的微生物处理中，BL、BC和BM对土壤pH值的改善效果最为显著，其改善程度依次为BM > BL > BC。同时，这些处理显著降低了土壤EC值，改善程度依次为BM > BS > BL。

在微生物群落多样性与组成方面，我们通过16S rRNA基因扩增子测序分析了BL、BC、BM和CK处理对红枣根际微生物群落的影响。结果显示，滴灌耐盐PGPB显著提高了土壤微生物的多样性。例如，BL、BC和BM处理组的丰富度指数（Richness index）分别比对照组提高了23.6%、22.8%和25.0%。香农指数（Shannon index）也分别提高了14.6%、16.7%和8.0%。这些处理组的OTU数量显著高于对照组（见附录A的图S1）。此外，与对照组相比，滴灌耐盐PGPB显著增加了与这些菌株相关的芽孢杆菌属（Bacillus）的相对丰度（见附录A的图S3）。

在微生物群落功能方面，我们使用FAPROTAX数据库分析了不同PGPB处理对土壤微生物功能的潜在影响。结果显示，BL、BC和BM处理均减少了硝酸盐和氮呼吸、植物病原菌和芳香化合物降解等功能。同时，这些处理对微生物群落功能的提升也有所不同：BL处理增强了氮固定和光异养功能；BC处理促进了硝酸盐还原、木质素分解和有机碳降解；BM处理则增强了发酵、几丁质分解和好氧异养功能。此外，我们构建了微生物群落的共现网络，以分析不同土壤样本中微生物之间的相互作用。共现网络由OTU间的相关性矩阵构建，仅保留相对丰度大于0.5%的OTU进行分析。对照组（CK）的共现网络包含150个节点和932条连接，而BL、BC和BM处理组的网络节点数量分别为178、185和170。滴灌耐盐PGPB显著增加了网络的平均度（AD）和平均路径长度（APL），同时降低了网络的模块性。这些网络中还观察到了显著的共现关键物种（keystone taxa）变化，如CK组中的f_kineosporiaceae，BL组中的Bauldia、Terrimonas和Microvirga，BC组中的Gaiella、Terrimonas和g_unclassified，以及BM组中的f_Devosaceae、c_KD4-96和Microvirga。

在土壤化学性质、红枣产量和品质以及微生物群落之间的关系方面，我们通过皮尔逊相关性分析研究了这些指标之间的相互关系。结果表明，PGPB处理组的这些指标之间存在显著相关性，且土壤盐碱度与大多数微生物指标之间存在显著负相关。然而，不同PGPB处理对这些指标的贡献有所不同。例如，在BL、BC和BM处理中，土壤盐碱度对红枣产量和品质的贡献分别为0.8%、0.1%和1.2%；土壤养分对红枣产量和品质的贡献分别为49.6%、11.9%和25.8%；而植物抗氧化酶对红枣产量和品质的贡献分别为0.3%、0.1%和1.1%。这些结果表明，不同PGPB处理对红枣产量和品质的影响机制存在差异。

在讨论部分，我们探讨了滴灌耐盐PGPB对红枣根际微生物群落的影响。根际是土壤微生物与植物根部密切互动的特殊环境，对微生物群落的形成和演替具有重要影响。本研究发现，滴灌耐盐PGPB显著提高了土壤微生物的多样性，这一现象与之前的研究结果一致，即BM、BC和BL的施用能够促进干旱或盐碱条件下土壤养分的可利用性和植物生长。值得注意的是，BM处理的土壤微生物多样性相对较低，这可能与其特殊的生理特性有关。BC能够产生脂肽、聚酮、环状多肽和挥发性抗菌物质，从而对根际中的某些细菌物种起到拮抗作用，这可能解释了BC处理下土壤微生物多样性的降低。此外，滴灌耐盐PGPB通过增加土壤中功能微生物的相对丰度，如Cyanobacteria和Nitrospirota，对土壤微生物群落结构产生了积极影响。

在植物适应盐胁迫方面，我们发现滴灌耐盐PGPB显著提高了红枣的抗氧化酶活性，如SOD、POD和CAT，从而减轻了由过量活性氧（ROS）引起的氧化损伤。耐盐PGPB能够通过增加植物中抗氧化酶基因的表达水平，激活植物的抗氧化防御机制。例如，BC能够刺激马铃薯中SOD、POD和CAT编码mRNA的上调。此外，耐盐PGPB还能通过提供足够的底物，间接促进抗氧化酶的活性，如SOD的合成。这些结果表明，耐盐PGPB在缓解植物盐胁迫方面具有重要作用。

在工程应用潜力方面，我们评估了滴灌耐盐PGPB在实际应用中的可行性。本研究中，耐盐PGPB以较小的剂量通过滴灌系统高频次地施用于红枣根部，同时提供了水分和养分，创造了有利于微生物生长的环境。这种处理方式不仅促进了微生物的定植和繁殖，还取得了比土壤基部施用和种子包衣更好的效果。尽管所有耐盐PGPB处理对土壤和作物均产生了积极影响，但不同菌株的促进效果存在显著差异。例如，BM处理下的果实VC和SS含量显著高于其他处理。K作为植物细胞电稳定性和酶活化的重要来源，管理着碳水化合物合成、矿质吸收速率和同化产物运输。因此，土壤中K含量的增加有助于植物合成蛋白质、糖和淀粉。此外，我们评估了滴灌系统在两年试验后的性能，并发现滴灌耐盐PGPB并未加剧滴灌头的堵塞，反而有效缓解了这一问题（见附录A的表S4）。从成本效益分析来看，PGPB的使用成本相对较低，且可以通过现有的肥料设备进行施用，无需额外的设备投入。因此，滴灌施用耐盐PGPB是一种经济、便捷且有效的改善盐碱土壤的方法。未来的研究应进一步探讨不同PGPB浓度下的水肥耦合效应及其对作物产量和品质的影响机制。