乳酸杆菌在Galleria mellonella模型中的先天免疫调节功能：植物乳杆菌与开菲尔乳杆菌的比较研究揭示临床前筛选新策略

本推荐语：本研究创新性地利用大蜡螟（Galleria mellonella）无脊椎动物模型，系统比较植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和开菲尔乳杆菌（Lentilactobacillus kefiri）的免疫调节特性。通过时序qRT-PCR分析Toll/IMD通路关键基因（Dorsal、Relish、18w等）及抗菌效应因子（gallerimycin、gloverin等）的表达模式，揭示菌株特异性免疫激活特征，为益生菌的临床前筛选提供高效、符合3R原则的替代方案。

　　

引言：乳酸杆菌（LAB）作为重要的益生菌类群，通过菌株特异性分子模式调节宿主免疫。大蜡螟（Galleria mellonella）无脊椎动物模型具有高度保守的先天免疫通路，近年来被广泛应用于益生菌功能的临床前筛选。本研究旨在通过该模型系统比较植物乳杆菌ATCC 14917（LP）和开菲尔乳杆菌DSM 10551（LK）的免疫调节活性。

方法：研究采用体重270-330 mg的末龄幼虫，通过腹部伪肢注射10⁶ CFU/幼虫的菌悬液。在72小时内监测生存率和健康指数，并通过qRT-PCR技术分析3-24小时内10个先天免疫相关基因的时序表达变化，包括Toll和IMD信号通路关键因子（Dorsal、Rel、cad）、Toll受体（18w）、细胞因子样配体（spz4）以及抗菌效应因子（gallerimycin、gloverin）。同时采用相关性和层次聚类分析鉴定共表达模块和菌株特异性转录模式。

结果：

生存与健康状态：所有实验组（LP、LK及PBS对照组）在72小时观察期内均未出现死亡现象。幼虫未表现黑化、运动能力下降或结茧障碍等应激体征，健康指数评分均接近满分10分，表明所选接种浓度（1.3±0.2×10⁵ CFU/幼虫）适用于后续实验。

生物信息学分析：通过NCBI BLASTP比对发现，G. mellonella免疫相关蛋白与人类同源物存在不同程度的保守性。其中Hem蛋白（XP_026755739.2）与人类NCKAP1（NP_038464.1）显示最高同源性（比特值1459，覆盖率99%， identity 61.85%）。NADPH oxidase 4-like（XP_026757760.2）与人类NOX4（NP_058627.2）比对参数为比特值281，覆盖率73%。转录因子Dorsal（XP_052755011.1）与人类NF-κB p65（NP_068810.3）显示中等保守性（比特值242，覆盖率37%）。值得注意的是，spaetzle、gloverin和gallerimycin未发现显著的人类同源序列。

基因表达时序分析：

Dorsal基因在两种处理中均呈现早期瞬时表达模式，12小时达到峰值后下降。LP处理组表达水平始终高于LK组，表明其对Toll通路的激活更强。

Rel基因表达在12小时达到高峰，LP组表达量（M=6.677）显著高于LK组（M=4.512），18小时后急剧下降至低水平，显示IMD通路的强烈但瞬时激活。

cad基因在6小时出现表达高峰，LP组呈现更强且持续的激活（M=2.305），而LK组激活较弱且持续时间短。

18w基因呈现双相表达模式，3小时初始诱导后6小时下降，12小时再次升高。LP组在18小时表达显著高于LK组（p<0.05）。

spz4表达在6小时达到峰值后迅速下降，LP组诱导水平更高，表明其产生更强的细胞因子样信号。

抗菌肽基因中，gallerimycin在12小时表达达到峰值，LP组诱导水平（M=39.515）显著高于LK组（M=29.622）。gloverin在6小时即出现强效诱导（LP组M=19.220），显示早期抗菌反应。

NADPH oxidase 4-like表达呈现菌株依赖性模式：LP诱导渐进性增加，18小时达到峰值；LK则呈现早期（6小时）但不够持续的峰值。18小时时LP组表达显著高于LK组（p<0.01）。

Hem基因在LK组中3小时即达峰值（M=2.605），而LP组延迟至6小时达到相似水平，表明菌株特异性血细胞动员模式。

IMPI表达显示最显著的时序差异：LP诱导早期（3小时）亚基线激活，18小时后显著下调；LK则呈现双相 profile，6小时过表达后12小时下降，18小时再次峰值。18小时时两组间存在显著差异（p<0.01）。

相关性分析：

基因间相关性显示，LP处理中Rel作为中枢节点，与cad、IMPI、gallerimycin和gloverin等多个基因显著相关（ρ=0.817-0.828）。NADPH oxidase 4-like与多数免疫基因呈负相关，表明其独立调控模式。LK处理中cad与大多数基因显著相关（ρ=0.384-0.763），spz4、gloverin、Hem和IMPI形成紧密共表达模块。

跨处理相关性分析表明，Dorsal、Rel、cad、spz4、gloverin和Hem基因在两种处理间呈现高度一致的时序模式（ρ=0.812-0.969）。而NADPH oxidase 4-like和IMPI在处理间无显著相关性，表明这些基因的调控具有菌株特异性。

层次聚类分析：

LP处理中基因形成两个主要簇：抗菌模块（spz4、gloverin、Hem）和调控簇（cad、Rel、IMPI），NADPH oxidase 4-like独立于主要簇外。LK处理中IMPI与抗菌模块聚集，NADPH oxidase 4-like与核心模块连接更紧密，18w则保持独立。

讨论：本研究证实G. mellonella作为体内模型能够有效区分不同乳酸杆菌菌株的免疫调节特性。LP诱导更强且持续的免疫信号通路和效应因子激活，而LK characterized by早期且 prolonged 的应激相关和组织保护机制激活。这些发现不仅揭示了菌株特异性免疫调节模式，也验证了G. mellonella作为成本效益高的替代模型用于益生菌功能筛选的潜力。通过比较昆虫与人类免疫系统的保守元件，本研究为将无脊椎动物模型发现向哺乳动物系统转化提供了理论基础，特别是在先天免疫调节机制方面。研究建立的时序表达谱和共表达网络为深入解析益生菌-宿主互作提供了重要框架，对开发具有特定免疫调节功能的益生菌制剂具有指导意义。