使用传统的冻干发酵剂对开菲尔进行发酵，能够成功重现新鲜发酵后的开菲尔风味

《Frontiers in Microbiology》：Fermentation of kefir with traditional freeze-dried starter cultures successfully recreates fresh culture fermented kefir

kefir发酵过程中使用乳糖和海藻糖作为保护剂进行冻干处理，验证了冻干技术对菌群存活率及发酵产物的影响。研究表明，冻干处理后的菌群仍能有效发酵牛奶，且在最终产品的微生物组成（如乳酸乳球菌、酿酒酵母等）、挥发性代谢物（如丁酸、己酸）及有机酸（乳酸、乙酸）含量上与新鲜菌群无显著差异，为工业化生产标准化菌群提供了依据。

　　发酵食品因其独特的风味、营养价值和潜在的健康益处而受到越来越多的关注。近年来，科学界对发酵食品中起关键作用的起始菌种（starter cultures）的研究不断深入，旨在开发既能保持传统发酵食品特征，又适合工业化生产的菌种组合。其中，酸奶饮品——开菲尔（kefir）因其丰富的微生物群落和多种健康益处，成为研究的重点。开菲尔的制作通常依赖于开菲尔颗粒（kefir grains），这是一种含有多种酵母和细菌的共生体系，能够通过复杂的代谢活动产生多种有益成分。然而，传统开菲尔颗粒在工业生产中面临诸多挑战，例如其保存条件较为苛刻、繁殖周期不稳定以及难以标准化。因此，研究者开始尝试构建人工的微生物菌群（reconstituted microbial consortia），以替代天然颗粒，从而实现开菲尔的工业化生产。本研究的重点在于评估两种常用的冻干保护剂——海藻糖（trehalose）和牛奶（milk）——对开菲尔起始菌种冻干后活性和发酵性能的影响，以期找到一种既能维持菌群稳定性，又能保持传统开菲尔健康特性的方法。

开菲尔是一种由多种细菌和酵母组成的复杂微生物群落，通常包括5种细菌和4种酵母。这些微生物在发酵过程中通过协同作用，产生多种有机酸、酯类、醇类等挥发性代谢产物，这些物质不仅影响开菲尔的风味，还可能对健康产生积极作用。例如，一些短链脂肪酸（如丁酸、乙酸）和中链脂肪酸（如己酸、辛酸）已被证明具有调节免疫系统、维持肠道黏膜结构以及改善宿主代谢功能等潜力。然而，传统的开菲尔颗粒在实际应用中存在诸多限制，包括难以长期保存、发酵过程不一致以及微生物组成可能随来源不同而变化。为了解决这些问题，研究团队构建了一种由9种核心菌种组成的开菲尔菌群，能够有效再现传统开菲尔的健康功能，如降低血液中的胆固醇水平。这一人工菌群的建立为工业生产提供了新的可能性，但如何在冻干过程中保持其活性和代谢能力仍然是一个关键问题。

冻干技术（freeze-drying）作为一种常见的微生物保存方法，已被广泛应用于食品发酵领域，如酸奶、酸面包、康普茶和奶酪等。该技术通过将微生物细胞在低温下脱水，使其在干燥状态下仍能保持活性，从而便于储存和运输。在本研究中，研究者选择了海藻糖和牛奶作为冻干保护剂，以评估它们对开菲尔菌群活性的影响。海藻糖是一种天然的双糖，具有较强的抗冻性和保湿能力，能够有效保护细胞免受冻干过程中的物理和化学损伤。而牛奶作为一种复杂的营养基质，不仅含有多种碳水化合物、脂肪和蛋白质，还可能通过提供必要的营养物质和稳定细胞结构来增强菌种的存活率。这两种保护剂的选择基于其在多种酵母和细菌中的广泛应用和良好的保护效果，同时也便于工业化生产。

在实验设计中，研究者首先对5种细菌和4种酵母进行了冻干处理，并在冻干后进行活性检测。结果显示，无论是使用海藻糖还是牛奶作为保护剂，细菌和酵母的存活率均较高，且两者之间没有显著差异。然而，酵母的存活率略低于细菌，这与以往的研究结果一致，表明酵母在冻干过程中更容易受到损伤。为了确保冻干菌种在发酵时具有与新鲜菌种相同的接种量，研究者对冻干后的菌种进行了精确称量，并将其与新鲜菌种以相同的接种率用于开菲尔发酵。发酵过程中的pH值、微生物组成、挥发性代谢物和有机酸的生成情况均被详细监测。结果表明，虽然使用牛奶作为保护剂的冻干菌种在发酵初期需要更长时间才能达到目标pH值（低于4.5），但最终的发酵产物在微生物组成和代谢产物水平上与新鲜菌种发酵的开菲尔没有显著差异。

进一步的分析显示，冻干菌种在发酵结束后仍能维持与新鲜菌种相似的微生物群落结构。通过浅层宏基因组测序，研究者发现所有样品中乳酸乳球菌（Lactococcus cremoris）的相对丰度均在93.4%至95.0%之间，而开菲尔菌（Lentilactobacillus kefiri）的相对丰度约为5%。其他菌种如莱克氏乳杆菌（Leuconostoc mesenteroides）、单孢酵母（Monosporozyma unispora）、马克斯氏酵母（Kluyveromyces marxianus）和发酵酵母（Pichia fermentans）在多数样品中被检测到，但它们的相对丰度均低于1%。值得注意的是，尽管这些菌种在发酵过程中未表现出显著的丰度变化，但它们的代谢活动可能在发酵的早期阶段更为活跃，从而影响挥发性代谢物的生成。例如，一些研究表明，开菲尔菌和乳酸乳球菌可能在发酵初期快速代谢乳糖，生成丁酸、己酸和辛酸等关键挥发性物质，这些物质不仅决定了开菲尔的风味，还可能对健康产生积极影响。

挥发性代谢物的分析进一步支持了这一观点。通过固相微萃取结合二维气相色谱-飞行时间质谱（SPME-GC × GC-TOFMS）技术，研究者发现冻干菌种发酵的开菲尔与新鲜菌种发酵的开菲尔在挥发性代谢物的种类和浓度上没有显著差异。这意味着冻干菌种在发酵过程中能够维持其原有的代谢能力，从而保证最终产品的风味和健康特性。此外，高效液相色谱（HPLC）分析显示，无论是使用海藻糖还是牛奶作为保护剂，冻干菌种在发酵后的有机酸和糖类浓度上均与新鲜菌种发酵的开菲尔保持一致。这一结果表明，冻干并未影响微生物的代谢活动，而是能够有效地保留其原有的功能特性。

从健康角度来看，开菲尔的发酵产物中包含的多种有机酸和酯类化合物已被证实具有潜在的益处。例如，短链脂肪酸如丁酸和乙酸可能通过调节肠道菌群和增强免疫功能来促进健康，而中链脂肪酸如己酸和辛酸则可能通过改善胰岛素敏感性和促进脂肪代谢来发挥积极作用。这些代谢产物的稳定性对于开菲尔的健康效益至关重要，因为它们在发酵过程中被释放并进入最终产品中。本研究的结果表明，冻干菌种能够保持这些关键代谢产物的生成，从而确保开菲尔在工业化生产中仍能提供与传统产品相似的健康益处。

尽管冻干菌种在发酵后的代谢产物和微生物组成上与新鲜菌种相似，但发酵时间的延长仍是一个值得关注的问题。使用牛奶作为保护剂的冻干菌种在发酵过程中需要更长的时间才能达到目标pH值，这可能与冻干过程中微生物的活性受到一定程度的影响有关。然而，这种影响在发酵结束后并未持续，说明冻干菌种在适应环境后仍能恢复其代谢能力。此外，一些研究认为，冻干过程中微生物可能经历了一定的应激反应，例如通过激活与应激相关的基因来增强其生存能力。例如，海藻糖已被证明能够帮助酵母在乙醇和低温等应激条件下维持细胞结构和功能，而牛奶中的营养成分可能为微生物提供了必要的支持，使其在冻干后能够更快地恢复活性。

从实际应用的角度来看，冻干技术为开菲尔的工业化生产提供了重要的技术支持。传统的开菲尔颗粒不仅难以大规模保存和运输，还可能因环境变化导致微生物组成不稳定，从而影响最终产品的质量。而冻干菌种的使用可以显著提高生产效率和产品的一致性，同时减少对天然开菲尔颗粒的依赖。此外，冻干菌种的保存期限更长，便于在不同地区和不同季节进行生产，这在满足市场需求的同时，也有助于减少资源浪费和环境污染。然而，尽管本研究的结果令人鼓舞，但仍有一些问题需要进一步探索。例如，冻干菌种在发酵过程中的动态变化，特别是在发酵初期和中期的代谢活动，可能对最终产品的风味和健康效益产生影响。因此，未来的研究应考虑对发酵过程进行时间序列分析，以更全面地了解冻干菌种在不同阶段的表现。

另一个值得关注的方面是冻干菌种在发酵过程中是否能够维持其原有的代谢功能，特别是在生成某些特定代谢产物（如生物活性肽）方面。这些肽类物质在发酵过程中可能通过分解蛋白质生成，并具有多种生理功能，如抗氧化、抗炎和调节免疫反应等。因此，未来的研究还应评估冻干菌种在发酵过程中是否能够生成这些重要的代谢产物，以确保其健康效益的完整性。此外，感官特性如味道、香气、口感等也是影响开菲尔市场接受度的重要因素。尽管本研究主要关注微生物组成和代谢产物，但未来的商业化应用仍需对这些感官属性进行详细评估，以确保最终产品能够满足消费者的期望。

总体而言，本研究为开菲尔的工业化生产提供了重要的理论和技术支持。通过使用海藻糖和牛奶作为冻干保护剂，研究者成功地保持了开菲尔菌群的活性和代谢能力，使得冻干菌种能够在发酵过程中再现传统开菲尔的健康功能和风味特征。这一成果不仅有助于提高生产效率和产品一致性，还为开菲尔在食品工业中的广泛应用提供了新的可能性。然而，为了进一步推动这一技术的商业化，还需要对冻干菌种在发酵过程中的动态变化进行更深入的研究，并评估其在不同条件下的稳定性和适用性。此外，感官特性和生物活性肽的生成情况也应成为未来研究的重点，以确保冻干开菲尔在保持传统健康益处的同时，也能满足消费者对风味和口感的需求。随着相关技术的不断进步，冻干菌种有望成为传统发酵食品工业化生产的重要工具，为人类健康和食品产业的发展做出更大贡献。